微生物接种剂及延迟密封对玉米秸秆青贮品质和有氧稳定性的影响

■左飒飒 牛东泽 郑明利 江 迪 徐春城

(中国农业大学工学院，北京100083)

根据农业部种植业管理司的统计数据，我国2014年的玉米产量为21 565万吨[1]，按照玉米籽粒与秸秆1∶1.2的比例推算，2014年我国玉米秸秆的产量为25 878万吨。玉米秸秆是反刍动物重要的粗饲料资源，然而，在我国每年约1/4的秸秆被直接焚烧[2]，既浪费资源，又污染环境。玉米秸秆由于可溶性碳水化合物含量低，木质纤维素含量高，消化性差等营养缺陷，导致其饲料利用率较低。因此，通过现代农业生物技术和发酵工程技术手段改善玉米秸秆营养价值、提高秸秆利用效率逐渐成为研究热点[3-5]。

生物接种剂主要包括微生物制剂和酶制剂。添加微生物制剂的目的是依靠以乳酸菌为主的有益菌，迅速将青绿饲料中的可溶性碳水化合物（WSC）转化为有机酸（主要为乳酸），使青贮饲料的pH值迅速下降，抑制其他好氧微生物对青绿饲料营养成分的分解作用，从而使青绿饲料得以保存[6]。而添加纤维素酶制剂则使饲料中的纤维素在纤维素酶的作用下，部分被酶解转化为WSC，作为乳酸菌（LAB）的发酵底物[7]，从而提高青贮的发酵品质。青贮饲料开封后，由于好氧细菌、酵母、霉菌的活动，导致饲料发生好氧变质，其主要表现为温度、pH值上升以及真菌菌斑的出现等[8]。通常情况下，当开封后青贮饲料的温度高于环境温度2℃视为变质，并且从开封到温度上升2℃所用的时间长短来衡量青贮饲料有氧稳定性的好坏[9]。

本试验旨在通过向新鲜玉米秸秆中添加具有分解纤维素能力的霉菌，在延迟密封的过程中，将玉米秸秆中的部分纤维素降解为可溶性糖，为乳酸菌提供发酵底物，加速乳酸菌发酵进程，以期提高玉米秸秆的青贮品质。并通过开封后有机酸、pH值以及温度的检测，评价微生物接种剂和延迟密封对青贮玉米秸秆有氧稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 玉米秸秆

试验原料取自江西省修水县中国农业大学修水教授工作站，完熟期新鲜玉米秸秆。

1.1.2 微生物接种剂

试验所用乳酸菌为本实验室分离纯化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum KM005155）。所用霉菌为黑曲霉（Aspergillus nigerCGMCC 3.1858）和里氏木霉（Trichoderma reeseiCGMCC 3.3711），购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验设计

采用随机区组设计，设对照组（CK）和乳酸菌组（LAB）、黑曲霉+乳酸菌组（As+LAB）、里氏木霉+乳酸菌组（Tr+LAB）以及黑曲霉+里氏木霉+乳酸菌组（As+Tr+LAB）添加组，共5组，每组3个重复。微生物接种剂按照原料鲜重的50 ml/kg添加，对照组添加同等量的蒸馏水，接种后，分别延迟0、24、48 h后抽真空密封。于贮藏第56 d开封，进行发酵品质及化学成分分析以及有氧稳定性试验。

1.3 试验方法

1.3.1 微生物接种剂的制备

将保藏乳酸菌菌种活化后转接一环于MRS液体培养基中，置于37℃、120 r/min摇床培养箱中培养12 h，活菌数达到1×109cfu/ml。黑曲霉和里氏木霉则以孢子悬浮液的形式进行接种，其制备方法为：将保藏菌株转接一环于PDA培养基上，放入28℃培养箱中培养5～7 d。每个培养皿中加入20 ml无菌水，用涂布棒轻轻刮掉孢子，四层无菌纱布过滤到灭菌的三角瓶内，加入灭菌的玻璃珠分散孢子后，适当稀释，经血球计数板计数，使孢子数目处于107cfu/ml，4℃条件下保藏备用。

1.3.2 青贮饲料的调制

将收获的新鲜玉米秸秆切碎至1～2 cm，根据1.2节的试验设计添加不同的微生物接种剂充分混匀后，装入200×150 mm的青贮专用聚乙烯袋，每袋约200 g，分别于0、24、48 h后，抽真空密封，室温条件下(18～25 ℃)避光贮藏。

1.3.3 青贮饲料的有氧稳定性试验

将开封后的青贮玉米秸秆每袋各取出100 g，充分混匀后放入保温材料桶中，将温度传感器插入样品中心进行温度监测，温度数据的采集使用data Taker DT85采集装置（澳大利亚 Datataker）进行测定，采集时间设置为1 h；定期混匀取样分析（根据具体变质情况确定取样时间）；当样品温度高于环境温度2℃时视为样品变质，在变质时取样进行分析。

1.3.4 测定项目和分析方法

青贮袋开封后，将青贮料取出并充分混匀。取10 g样品装入灭菌的聚乙烯袋，于超净工作台内加入90 ml灭菌去离子水，用无菌均质器处理1 min，浸提3 h后，再通过4层纱布及定性滤纸过滤，得到青贮饲料浸提液，用于pH值测定及微生物的稀释平板菌落计数。剩余青贮饲料样品于65℃鼓风干燥48 h后，测定干物质（DM），粉碎过1 mm筛备用。pH值用pH计（Mettler To⁃ledo-S20,Switzerland）测定；微生物组成采用平板计数法进行测定[10]；粗蛋白质（CP）采用凯氏定氮法进行测定[11]；中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）采用范式纤维法进行测定[12]；NH3-N采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[13]；可溶性碳水化合物（WSC）采用蒽酮硫酸法进行测定[14]；有机酸采用高效液相色谱法进行测定[15]。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0的 two-way anova分析微生物接种剂及延迟密封以及二者的交互作用对玉米秸秆青贮微生物组成、发酵品质、化学成分及开封后发生有氧变质时的发酵品质和化学成分的影响；多重比较采用Duncan's方法，显著水平设置为P＜0.05。

2 试验结果

2.1 玉米秸秆的原料特性(见表1)

表1 青贮玉米秸秆原料化学组成(%)

玉米秸秆的化学组成如表1所示。新鲜玉米秸秆的DM含量为25.28%；而WSC含量较低，仅为5.83%DM。

2.2 玉米秸秆青贮的微生物组成（见表2）

如表2所示，微生物接种剂对玉米秸秆青贮的乳酸菌和好氧细菌的数量无显著影响（P＞0.05），但显著增加了酵母菌数量（P＜0.05）；延迟密封对青贮微生物群落影响显著（P＜0.05），随着延迟密封时间的增长，乳酸菌数量显著上升，酵母菌数量显著下降（P＜0.05）。所有处理组中均未检测到霉菌及肠细菌。

表2 微生物接种剂和延迟密封对玉米秸秆青贮微生物组成的影响(log10cfu/g FM)

2.3 玉米秸秆青贮发酵品质（见表3）

表3 微生物接种剂和延迟密封对玉米秸秆青贮发酵品质的影响

所有试验组的发酵品质良好，表现在pH值低于3.8，氨态氮占总氮的比值低于10%（见表3）。与CK组相比，添加微生物接种剂对pH值影响不显著（P＞0.05），但对有机酸和氨态氮含量的影响显著(P＜0.05)。其中添加Tr组的乳酸含量高于其他处理组；Tr+LAB组的乙酸含量则低于除CK组外的其他组；添加As+Tr+LAB组的丙酸和丁酸含量最低。延迟密封时间对pH值影响显著(P＜0.05)，随着密封时间的延迟，pH值显著上升。微生物接种剂和延迟密封时间对青贮饲料中氨态氮含量影响均显著（P＜0.05），其中Tr+LAB组的氨态氮含量高于其他微生物接种组，而As+Tr+LAB组的氨态氮含量与CK组无显著差异；另外，随着延迟密封时间的增长，氨态氮含量也显著上升（P＜0.05）。

2.4 玉米秸秆青贮的化学成分(见表4)

表4 微生物添加剂和延迟密封对玉米秸秆青贮化学成分的影响

由表4可知，经过56 d发酵后的玉米秸秆随着延迟密封时间的增长，DM含量显著下降（P＜0.05），NDF、ADF、CP含量显著上升（P＜0.05）；对于微生物接种剂，除了As+Tr+LAB组的NDF含量显著下降外，其他组各成分均无显著影响。

2.5 玉米秸秆有氧状态下的发酵品质和化学成分(见表5)

发酵56 d的玉米秸秆开封后，处理组和CK组在延迟0 h和延迟48 h密封条件下开封后均在144 h发生变质，而延迟24 h密封条件下的各组开封后均在160 h发生有氧变质。变质时的品质和化学成分如表5所示。经过24 h延迟密封后的玉米秸秆在160 h发生变质时的pH值最低，保留的乳酸含量最高；NDF、ADF含量最低，CP含量最高。

3 讨论

3.1 玉米秸秆的原料特性

玉米秸秆是收获玉米后的副产品，水分含量75%左右，秸秆中的主要成分是木质纤维素，由纤维素、半纤维素和木质素组成，是反刍动物良好的粗饲料来源。本试验的玉米秸秆中，CP含量7.41%DM，约为风干玉米秸秆的2倍[1]，约为全株玉米青贮的85%；WSC含量5.83%DM，约为全株玉米青贮的35%；NDF（57.64%DM）和ADF（31.48%DM）含量均高于全株玉米青贮[3]。

表5 青贮玉米秸秆在有氧条件下的发酵品质和化学成分分析

乳酸菌作为乳酸发酵的启动菌，在青贮过程中起着主导作用。一般情况下，当原料表面附着乳酸菌数量达到或超过105cfu/g FM时，才能确保青贮的顺利进行[16]。制作青贮饲料时，要使乳酸菌能够快速生长繁殖，青贮原料应具有适宜的DM含量、一定的WSC含量及较低的缓冲能[17]。本试验中的玉米秸秆中WSC含量仅有5.83%DM，为了提高其发酵品质，添加了乳酸菌和能产生纤维素分解酶的曲霉、木霉等真菌。Sun等[18]研究了纤维素酶和乳酸菌对玉米秸秆不同部位青贮的影响，得出纤维素酶能够提高乳酸含量，降低DM、NDF及CP损失。本试验接种乳酸菌以及黑曲霉和里氏木霉，获得了同样的效果。

3.2 微生物接种剂及延迟密封对玉米秸秆青贮微生物群落的影响

添加微生物接种剂对乳酸菌的数量没有显著影响，这可能与玉米秸秆原料本身附着的乳酸菌有关。经过56 d贮藏，酵母菌的数量显著降低，但添加霉菌促进了酵母菌的生长。随着延迟密封时间的增长，乳酸菌数量显著上升，酵母菌数量显著下降，表明霉菌分泌的纤维素酶起了一定的作用，导致纤维素降解为能够被乳酸菌吸收利用的WSC，从而促进了乳酸菌的生长繁殖[19]。

3.3 微生物接种剂和延迟密封对玉米秸秆青贮发酵品质的影响

添加微生物接种剂后玉米秸秆青贮pH值在3.63～3.68之间，和CK组的3.58相比没有显著差异（P＞0.05），这可能与本试验所用的玉米秸秆原料水分适宜等条件有关。添加有Tr组的乳酸含量高于其他处理组，表明里氏木霉分泌的纤维素酶将纤维素分解后促使乳酸菌发酵，提高了乳酸含量；Tr+LAB组的乙酸含量则低于除CK组外的其他组；添加As+Tr+LAB组的丙酸和丁酸含量则最低，说明不同的微生物接种剂对有机酸各成分的影响不同，但总体来看As+Tr+LAB组能有效改善玉米秸秆的青贮品质。

本试验中，延迟密封对玉米秸秆的青贮品质没有改善作用，但随着延迟时间的增长，乳酸菌数量显著上升，酵母菌数量显著下降，这可能对开封后的有氧稳定性有一定的促进作用。

3.4 微生物接种剂和延迟密封对玉米秸秆青贮营养成分的影响

添加有里氏木霉组的DM损失显著高于CK组，和LAB组、As+Tr+LAB组差异不显著，说明微生物接种剂会造成青贮原料的干物质损失，但即使在不考虑干物质损失的情况下，As+Tr+LAB组的NDF、ADF含量也显著低于CK组，表明As+Tr+LAB组合降解了部分纤维素，将其分解后促使乳酸菌发酵提高了乳酸含量。随着延迟密封时间的增长，NDF、ADF和CP含量显著上升，且延迟48 h密封的CP、NDF及ADF含量略高于CK组，这可能是由于随着密封时间的延迟，酵母、霉菌等好氧微生物对原料中可溶性碳水化合物和纤维素的利用造成的基质损失，导致其他组分在干样中的相对含量升高。

3.5 微生物接种剂和延迟密封对玉米秸秆青贮有氧稳定性的影响

添加微生物接种剂不会改变玉米秸秆青贮的有氧稳定性，表现在添加微生物接种剂与CK组同时变质，但延迟24 h后密封发酵的玉米秸秆比延迟0 h和48 h密封后的玉米秸秆有氧稳定性更好，这可能与延迟24 h霉菌在一定程度上的萌发抑制了酵母的大量繁殖有关。

4 结论

复合接种黑曲霉、里氏木霉和乳酸菌可以显著提高玉米秸秆的青贮发酵品质；延迟密封能够显著改变玉米秸秆青贮的微生物群落，且延迟24 h密封有利于玉米秸秆青贮的有氧稳定性，但对玉米秸秆青贮品质的提高没有促进作用。