医院感染肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性分析

江丹英 林雪峰 王兵勇 陈静 应华永

[摘要] 目的 了解医院感染肺炎克雷伯菌的临床分布及对常用抗菌药物的耐药性，为临床预防肺炎克雷伯菌相关医院感染及合理选用抗菌药物提供依据。 方法 收集2012年1月～2014年12月医院感染患者临床标本中分离到的肺炎克雷伯菌，利用西门子WalkAway96全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏试验，采用CLSI推荐的ESBLs表型确证试验、三维试验、Hodge试验分别对ESBLs酶、AmpC酶和KPC型碳青霉烯酶进行检测，数据分析采用WHONET5.6和MDR1.0。 结果 1014株肺炎克雷伯菌主要分布在重症监护病房（19.92%）和新生儿病房（11.34%），主要来源于呼吸道标本（52.27%）和尿液标本（17.16%）。肺炎克雷伯菌对不同抗菌药物呈不同程度的耐药性，其中对亚胺培南、美洛培南、头孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星的耐药率最低（均低于7.4%），对哌拉西林的耐药率最高（81.76%）。1014株肺炎克雷伯菌中，35.11%为产ESBLs菌株，15.98%为产AmpC酶菌株，5.03%为产KPC酶菌株，50.98%为多重耐药菌株。 结论 医院感染肺炎克雷伯菌的耐药性日趋严重，监测肺炎克雷伯菌的耐药趋势及产酶情况对指导临床用药有重要意义。

[关键词] 肺炎克雷伯菌；分离率；来源分布；耐药性

[中图分类号] R378.9 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）34-0117-04

Clinical distribution and drug resistance of Klebsiella pneumoniae causing nosocomial infections

JIANG Danying1 LIN Xuefeng1 WANG Bingyong1 CHEN Jing1 YING Huayong2

1.Medical Center， Yueqing Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College， Yueqing 325600， China； 2. Clinical Laboratory， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective By analysising the distribution and drug resistance of Klebsiella pneumoniae （KPN）， to prevent pneumonia klebsiella bacteria causing nosocomial infections， to reasonably chose antibiotic agents. Methods The KPN isolated from nosocomial infections patients's clinical specimens from January 2012 to December 2014 was collected. Bacterial identification and drug susceptibility testing were performed by Siemens WalkAway96 automatic microbial analyzer， ESBLs enzymes were tested by ESBLs phenotypic corroboration test， AmpC enzyme was detected by three-dimensional test， and KPC enzyme was tested by Hodge test which were recommended by CLSI， data analysis was conducted by WHONET5.6 and MDR1.0. Results The 1014 strains of KPN were mainly distributed in intensive care unit （19.92%） and neonatal ward （11.34%）， mainly from respiratory tract specimens （52.27%） and urine specimens （17.16%）. The drug resistance of KPN was different to various antibiotics， resistance rate to imipenem， meropenem， Cefoperazone/sulbactam and amikacin was minimum （lower than 7.4%）， to piperacillin pull methicillin resistant rate was the highest （81.76%）. The detection rate in 1014 strains of Klebsiella pneumoniae of ESBLs， AmpC and KPC were 35.11%， 15.98% and 5.03%， Multiple drug-resistant was 50.98%. Conclusion Hospital infection Klebsiella pneumoniae bacteria drug resistance has become increasingly serious， Monitoring of Klebsiella pneumonia bacteria resistant trend and enzyme production has important significance to guide the clinical medication.

[Key words] Klebsiella pneumonia； Separation rate； Source distribution； Drug resistance

肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumonia，KPN）是引起医院感染最重要的致病菌之一，也是常见的多耐药菌，可引起肺炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症等疾病。近年来，随着抗菌药物，特别是广谱头孢菌素类和碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，使得该菌引起的医院感染呈上升趋势，其耐药性也日趋严重，特别是耐碳青霉烯类菌株的出现给临床治疗造成了极大困难[1]。 为了解我院医院感染肺炎克雷伯菌的临床分布特点以及对常用抗菌药物的耐药情况，希望能为临床治疗提供有效依据。本调查选择我院2012年1月～2014年12月医院感染患者送检标本中分离到的1014株肺炎克雷伯菌的临床分布和耐药性进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2012年1月～2014年12月医院感染患者临床标本中分离出的肺炎克雷伯菌，共1014株，同一患者相同标本多次分离的菌株不重复计入。

1.2 菌株鉴定及药敏试验

按《全国临床检验操作规程》进行细菌培养分离，使用西门子公司的WalkAway 96全自动微生物分析仪及配套试剂进行菌种鉴定和药敏试验。

1.3 ESBLs酶检测

采用西门子公司的WalkAway 96全自动微生物分析仪及配套试剂进行ESBLs酶检测，其中仪器进行头孢他啶和头孢他啶/克位维酸以及头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸的MIC测定，如果与克拉维酸联合的药物MIC相对单独药物MIC减低≥3个倍比稀释度，则判断为ESBLs酶阳性。

1.4 AmpC酶检测

筛选头孢西丁耐药的菌株进行AmpC酶检测，检测方法参见Coudron等[2]和江勇等[3]的方法进行检测：①酶的提取：Eppendorf管中加无菌蒸馏水1.5 mL，加入35℃过夜培养菌落2～3个，菌液浓度约10亿，放-20℃冰箱反复冻融5～8次，最后1次从冰箱取出，待解冻后（菌液约在0℃）马上放微型离心机中10 000 r/min离心5 min，取上清粗酶液备用。②三维试验检测：将大肠埃希菌ATCC25922稀释成0.5麦氏单位，涂布于90 mm的M-H平板上，平板中心贴头孢西丁30 μL纸片，距离纸片边缘5 mm处，用内径为2 mm无菌打孔器打孔，弃去挖出的琼脂，将提取的粗酶液30 μL加入打好的孔中，35℃过夜观察结果[2]。

1.5 KPC型碳青霉烯酶检测

筛选碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株进行检测，采用美国临床实验标准化委员会推荐的改良Hodge试验进行检测：将大肠埃希菌（ATCC25922）采用无菌生理盐水调成0.5麦氏浊度的菌悬液后用生理盐水再进行1∶10稀释，采用无菌棉签将稀释后菌液均匀涂布于M-H平板上，并将美洛培南纸片贴于M-H平板上，用无菌接种环挑取3～5个过夜生长待测肺炎克雷伯菌落从纸片边缘开始划线接种，划线长度为20～25 mm，经35℃孵育16～20 h后观察结果，如果在待测肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌（ATCC25922）抑菌圈交汇处见大肠埃希菌生长增强，即判断该待测肺炎克雷伯菌产KCP型碳青霉烯酶。

1.6 多重耐药菌株的定义

采用2010年美国、瑞典等国家的一些专家共同提出的《关于MDR、XDR、PDR术语国际标准化定义专家建议（草案）》[4]中对肠杆菌科细菌的MDR菌株的定义，即对以下16类抗菌药物中3类或3类以上抗菌药物不敏感株为多重耐药肺炎克雷伯菌。其中16类抗菌药物包括氨基糖苷类、碳青霉烯类、非广谱头孢菌素类、广谱头孢菌素类、头霉素类、叶酸代谢抑制剂、甘氨酰环素类、单环β-内酰胺类、氟喹诺酮类、青霉素类、抗假单胞菌青霉素+酶抑制剂、青霉素类+酶抑制剂、氯霉素类、磷酸类、多粘菌素类和四环素类。

1.7 统计学处理

应用WHO NET5.6软件对菌株分布及药敏资料进行统计分析，应用MDR1.0软件对肺炎克雷伯菌的多重耐药菌株进行统计分析。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌在不同标本中分布

3年来肺炎克雷伯菌在不同标本中的分布构成基本维持不变，1014株肺炎克雷伯菌中，来自呼吸道标本最多，占总标本数的52.27%，位列第2、第3和第4的分别是尿液、脓液及创口分泌物和血液，各占17.16%、13.81%和9.96%。见表1。

2.2 肺炎克雷伯菌在不同科室中分布

3年来肺炎克雷伯菌在不同科室中的分布基本维护不变，1014株肺炎克雷伯菌中，来自重症监护病房最多，占19.92%，其次是新生儿病房，占11.34%，见表2。

2.3 耐药情况

1014株肺炎克雷伯菌对23种抗菌药物呈不同程度的耐药性，其中对亚胺培南、美洛培南、头孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星的耐药率最低（均低于7.4%），对哌拉西林的耐药率最高（为81.76%）。1014株肺炎克雷伯菌对23种抗菌药物的药敏数据见表3。

表3 1014株肺炎克雷伯菌对23种抗菌药物的药敏率（%）

2.4 产ESBLs、产AmpC、产KPC型碳青霉烯酶和多重耐药肺炎克雷伯菌检出情况

1014株肺炎克雷伯菌中检出产ESBLs菌株356株，占35.11%，检出产AmpC菌株162株，占15.98%，检出产KPC型碳青霉烯酶菌株51株，占5.03%，检出多重耐药肺炎克雷伯菌517株，占50.98%。见表4。

表4 1014株肺炎克雷伯菌中产ESBLs、产AmpC、产KPC及多重耐药肺炎克雷伯菌检出情况

3 讨论

肺炎克雷伯菌是医院感染中重要的致病菌之一，可以感染人体的任何组织部位，长期住院、使用广谱抗生素、机械通气、留置导尿管等皆是肺炎克雷伯菌引起医院感染的危险因素[5，6]，我院近3年分离到的肺炎克雷伯菌主要来自呼吸道标本和尿液标本，两者合计占临床标本的2/3左右（69.43%），其中呼吸道标本占临床标本1/2以上（52.27%），可能与呼吸道标本与尿液标本占临床标本的比例有直接关系，同时亦表明肺炎克雷伯菌是呼吸道和泌尿道相关医院感染的重要病原菌，这与郝慧明等[7-9]报道结果基本一致。从肺炎克雷伯菌来源的不同科室来看，来自重症监护病房和新生儿病房的肺炎克雷伯菌占全院30个病房菌株数的1/3左右，分别为19.92%和11.34%，可能与重症监护病房和新生儿病房的患者病情严重和免疫力水平低下有关[10]。因此，医护人员应对重症监护病房、新生儿病房等肺炎克雷伯菌高发病房和呼吸道、泌尿道等易感部位做重点监测，以便尽早发现肺炎克雷伯菌相关医院感染，并采取有效措施及时控制。

肺炎克雷伯菌的主要耐药机制包括产生各种抗菌药物灭活酶、生物被膜和外膜孔蛋白缺失等引起的抗菌药物渗透障碍、主动外排泵系统的作用和药物作用靶位的改变等[11]。其中ESBLs是临床肺炎克雷伯菌耐药产生的最主要的一类灭活酶，该酶是由质粒介导的丝氨酸蛋白衍生物，能够水解青霉素类、广谱头孢菌素及单环β-内酰胺类药物，而且使得产ESBLs的细菌对氟喹诺酮类、磺胺类和氨基糖甙类抗菌药物交叉耐药[8]。AmpC酶主要是由染色体或质粒介导产生的一类作用于头孢菌素类抗菌药物且不被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶，与ESBLs酶不同的是AmpC酶对头孢西丁等头霉烯类抗菌药物高水平耐药，并不被克拉维酸抑制[12]。而KPC型碳青霉烯酶则是肺炎克雷伯菌耐药产生的后果最为严重的灭活酶，是属于BUSh分类中2f亚组的A类丝氨酸酶[13，14]，产碳青霉烯酶菌株对碳青霉烯类、青霉素类、广谱头孢菌素类及单环类抗菌药均耐药，会给临床治疗带来极大的困难，并且患者病程明显延长，死亡率也迅速升高[15]。本组数据显示，1014株KPN中检出产ESBLs菌356株，检出率35.11%，低于孔海深等[16]报告的54.6%，与李慧娟[17]报道的35.8%基本一致。1014株KPN中检出产AmpC菌162株，检出率为15.98%，高于钱海英报道的5.8%[8]，但低于郑港森等[18]报道的18.2%。检出产KPC型碳青霉烯酶菌51株，检出率为5.03%，与胡慧敏等[19]报道的5.4%基本一致，但高于刘素玲等[20]报道的2.4%。由此说明肺炎克雷伯菌耐药酶的检出率因不同地区、不同级别医院、不同时间而有不同程度的差异，可能与不同医院的用药习惯不同有关。药敏结果显示，多重耐药肺炎克雷伯菌的检出率为50.98%，其中哌拉西林的耐药率达91.76%，其他耐药率>40.0%的还包括头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南等药物，结合肺炎克雷伯菌的产酶情况，说明本地区肺炎克雷伯菌的耐药情况较严重。本组数据显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药率虽然最低，但仍存在耐药株，其中亚胺培南耐药率4.14%，美洛培南的耐药率3.75%，说明随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，肺炎克雷伯耐药菌株会逐步产生，需引起重视[22]。

总之，多重耐药肺炎克雷伯菌、产ESBLs和产AmpC肺炎克雷伯菌的高分离率及产KPC型碳青酶烯类菌株的出现，是临床抗感染治疗面临的重大问题，临床应对此引起足够的重视，并应结合药敏结果合理使用抗菌药物以减少耐药菌株的产生，应提高医院感染意识以控制产酶菌株在医院感染的发生与流行。

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（收稿日期：2015-07-17）