扶正剔邪搜络方改善肺纤维化大鼠肺功能的机制研究

扶正剔邪搜络方改善肺纤维化大鼠肺功能的机制研究

练毅刚1,张立山1,吴华阳1,闫玉琴2,王晨3,周绍忠1,关秋红1,李德莹1,苏惠萍1*

(1.北京中医药大学东直门医院，100700；2.北京市隆福医院，北京 100700；

3.怀柔区第一医院，北京 100700)

摘要：目的通过扶正剔邪搜络方治疗肺纤维化大鼠，观察不同时相大鼠肺功能与血清指标关系,探究其作用机制及适宜疗程。方法将128只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、中药组、激素组，每组32只。使用气管内推注博莱霉素以建立肺纤维化模型，正常对照组注射相同体积的生理盐水。造模后24 h，中药组使用扶正剔邪搜络方,0.74 g/(kg·d)，激素组使用泼尼松，5 mg/(kg·d)，正常对照组和模型组使用相同体积的生理盐水。在用药后第7、14、28、45 d时,分别观察每组肺吸气阻力(Ri)、顺应性(Cl)、用力肺活量(FVC)、吸气阻力(Ri)、呼出气量为25%～75%肺活量时平均流量(FEF25%-75%)变化、第0.2秒末呼出容积(Fev0.2)。结果1)与模型组比较，中药组14 d时FVC、FEF25%-75%、Cl显著性升高(P<0.01)，28，45 d时Fev0.2、Ri、FEF25%-75%、Cl差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。2)Ⅲ型胶原14、45 d中药组表达明显低于模型组。3)中药组Smad3、4蛋白表达明显低于西药组,Smad7蛋白表达明显高于西药组。结论扶正剔邪搜络方可改善肺纤维化大鼠肺功能，其作用机制为调节Smad蛋白及降低Ⅲ型胶原蛋白表达来延缓肺间质纤维化的进展。

关键词：扶正剔邪搜络方；肺纤维化；肺功能；机制研究；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.04.031

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)04-0410-05

基金项目:北京市自然科学基金资助项目(7102096)。

作者简介:练毅刚(1972-)，男，硕士研究生，主治医师，主要从事中医药防治肺间质纤维化研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-09-21)

*通信作者:苏惠萍,电话:010-84013357，电子信箱:suhuiping@126.com。

Mechanistic investigation of Fuzheng Tixie Souluo therapeutics on lung

function of pulmonary fibrosis rats

LIAN Yigang1,ZHANG Lishan1,WU Huayang1,YAN Yuqin2,WANG Chen3,ZHOU Shaozhong1,GUAN Qiuhong1,

LI Deying1,SU Huiping1*

(1.Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China;

2.Longfu Hospital of Beijing City,Beijing 100700,China;

3.The First Hospital of Huairou District,Beijing 100700,China)

Abstract:ObjectiveThrough Fuzheng Tixie Souluo therapeutics treatment for pulmonary fibrosis rat,observe the lung function of rat relation with serum index at various time phases and explore its mechanism of action and appropriate treatment.MethodsThe 128 SD male rats are divided into normal control group,model group,Chinese medicine group and hormone group at random,each of which has 32 rats.Except physiological saline of same volume is injected into the rats in normal control group,bleomycin is injected into the tracheas of the rats in each of other groups for modeling.After being modeled for 24 hours,Fuzheng Tixie Souluo therapeutics was used in Chinese medicine group,0.74g/(kg·d) administered;hormone group use prednisone,5 mg/(kg·d);meanwhile,the physiological saline of same volume is filled into the stomachs of the rats in other two groups till the previous day of use.On the 7 th day,14 th day,28 th day and 45 th day since administration,Observed in each group respectively the inspiratory resistance (Ri),compliance of lung (Cl),forced vital capacity (FVC),inspiratory resistance (Ri),exhaled air is 25%-75% vital capacity when the average flow rate change (FEF25%-75%),the 0.2 seconds end out of the volume (Fev0.2).Results1)Compared with the model group,on the 14th day,FVC,FEF25%-75%,Cl of Chinese medicine group obvious increase (P<0.01).On the 28 th and 45th days,forced expiration volume at 0.2 nd second (Fev 0.2),average expiration flow speed between expiration 25% VC and expiration 75% VC (FEF25%-75%),Ri and Cl are remarkably improved,the differences have statistical significances (P<0.01,P<0.05).2)Compared with that of the model group,the Co III in the Chinese medicine group is obviously weakened on the 14 th and 45 th days.3)The expressions of Smad 3 and Smad 4 in Chinese medicine group were weakened,while the expression of Smad 7 had enhanced.ConclusionFuzheng Tixie Souluo therapeutics can improve lung function of pulmonary fibrosis rats.The mechanisms may be related to the influenced by the regulation of the excessive expression of Smad,also followed the decline of Co Ⅲ.

Keywords:Fuzheng Tixie Souluo therapeutics;pulmonary fibrosis;lung function;mechanistic investigation;rat

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是多种病因导致的不同肺间质疾病的共同结局，具有致命性、进行性、慢性的疾病发展特点[1]。Dempsey等[2]报道IPF患者中位生存期约3年。本研究拟动态观察扶正剔邪搜络方治疗博莱霉素致大鼠肺间质纤维化不同时相肺功能变化，通过分析不同时相Smad3、Smad4、Smad7信号蛋白及细胞外基质(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原)指标的变化[3]，以期找到扶正剔邪搜络方治疗肺间质纤维化改善肺功能的作用机制。通过观察大鼠造模后肺功能特点，对我院呼吸科治疗肺间质纤维化用药规律总结,自拟扶正剔邪搜络方,观察其对肺纤维化大鼠不同时相肺功能的作用，以期为中医临床治疗肺间质纤维化的方法、时机及疗程提供实验依据并初步探讨作用机理。

1材料与方法

1.1动物128只健康清洁级大鼠，体质量(200±20) g，雄性，动物许可证号：SCXK(京)2006-0009，提供方为北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2药物与主要试剂扶正剔邪搜络方颗粒剂，药物组成：麦冬、人参、浙贝母、地龙、水蛭等8味中药，7.440 g/袋，批号：100829，提供方为北京康仁堂药业有限公司；盐酸博莱霉素，15 mg/瓶，批号：Y91450，提供方为日本化药株式会社；醋酸泼尼松龙，规格为：5 mL，0.125 g/支，批号：100514，浙江仙琚制药股份有限公司。Smad3、Smad4及Smad7检测试剂盒，北京尚柏生物有限公司。

1.3模型建立与分组大鼠128只，采用随机数字表法,分为正常对照组、模型组、中药组、激素组,每组32只。按照参考文献[4-5]制造大鼠肺纤维化模型，采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉并固定，提起大鼠舌头，用18号套管针从口腔水平插入，在到达咽喉部位时，压低针尾，让针头抬高15°～30°，在插入气管后，拔出针芯。使用棉球薄片，将其置于套管针外口，如果见到薄片随呼吸前后运动，说明套管针已在气管。此时通过气管插管快速注射博来霉素溶液(浓度0.2%，用量5 mg/kg，即2.5 mL/kg)，正常对照组注射相同体积的生理盐水；继续通过气管插管快速推注空气0.3 mL，并将大鼠立即直立旋转，以便药液均匀分布在双肺内。病理结果显示，7 d时出现明显肺泡炎，14 d可见肺泡炎较前减轻，肺间质纤维化开始形成，28 d时肺间质纤维化已经是主要病变，模型成功建立。

1.4给药在造模24 h之后，中药组参照人体与动物体表面积的折算系数,予以扶正剔邪搜络方颗粒剂，剂量为0.74 g/(kg·d)，使用去离子水制成药物混悬液；激素组给予醋酸泼尼松龙，剂量为5 mg/(kg·d)；模型组和正常对照组采用相同体积的生理盐水灌胃给药，1次/d。

1.5仪器动物呼吸机Res3020，动物肺功能分析系统AniRes2005(北京贝兰博科技有限公司)。

1.6指标检测

1.6.1肺功能检测7，14，28，45 d，依据随机数字表法各组取8只。因呼吸机与气切插管后麻醉大鼠配合问题，导致7 d中药组、激素组为7只，45 d正常对照组、激素组为7只。末次给药后1 h使用水合氯醛(浓度为10%，剂量按3.5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉，行气管切开，并将气管导管插入，之后与动物肺功能分析系统连接，测算出每组大鼠呼出气量为25%～75%肺活量时平均流量(FEF25%-75%)、第0.2秒末呼出容积(Fev0.2)、用力肺活量(FVC)、肺顺应性(Cl)、吸气阻力(Ri)。

1.6.2病理学检测肺功能检测后，摘取大鼠肺脏,使用多聚甲醛固定液(浓度为4%)固定左肺，常规脱水处理，使用石蜡包埋，切片厚度为5 μm，行Masson染色及HE染色。

1.6.3Smad3、Smad4及Smad7检测在液氮中保存分离的右肺上叶，使用RT-PCR检测,通过Bio Rad quanity one软件定量分析条带，内参抗体采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，使用Smad信号蛋白含量除以GAPDH，得出信号蛋白Smad的相对含量，尽量避免加样误差、RNA定量误差以及各PCR反应体系中各孔间的温差、扩增效率不均一等所造成的误差。

2结果

2.1病理结果正常对照组在不同时相肺泡间隔均未发现明显炎细胞浸润。模型组7 d时,间质出现不同程度炎症，Masson染色可以偶见少量胶原纤维[6]；14 d间质炎症明显，程度比7 d时减轻，而胶原纤维沉积增多明显；28 d时肺组织炎症较14 d程度减轻明显，肺泡的正常结构破坏，纤维化区增大、增多；第45天时大部分肺组织正常结构破坏，大量胶原纤维在病变区域沉积，严重病变处形成分房囊性结构，即“蜂窝肺”改变，Masson染色可以见到大量致密胶原纤维。上述结果符合大鼠肺间质纤维化模型表现[7-8]。

2.2肺功能中药组与模型组比较，7 d肺顺应性(Cl)、吸气阻力(Ri)开始改善，中药组14 d时FVC、FEF25%～75%、Cl显著性升高(P<0.01)，28，45 d时Fev0.2、Ri、FEF25%～75%、Cl差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

表1　不同时相各组大鼠肺功能比较 ± s)

注:与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01

2.3Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原相比正常对照组，模型组14，45 d时Ⅰ型胶原表达明显升高。中药组、激素组在不同时相Ⅰ型胶原表达无明显改善。见表2。

相比正常对照组，模型组14、28、45 d时Ⅲ型胶原表达明显升高。相比模型组，中药组14、45 d时，Ⅲ型胶原表达明显低于模型组。见表3。

2.4smad3、smad4、smad7干预组大鼠各时相Smad3、Smad4的表达值明显低于模型组,Smad7表达水平均高于模型组，中药组Smad3、4蛋白表达明显低于西药组，Smad7蛋白表达明显高于西药组。见表4～表6。

表2　各组不同时相Ⅰ型胶原表达结果 　ng/mL

注：同一时相，与模型组比较，# P<0.05，## P<0.01

注：同一时相，与模型组比较，# P<0.05，## P<0.01

注：同一时相，与激素组比较，## P<0.01；与模型组比较，△△ P<0.01

注：同一时相，与激素组比较，## P<0.01；与模型组比较，△△ P<0.01

注：同一时相，与激素组比较，##P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

3讨论

“初病在经在气”，肺纤维化发病初期邪气入络，病变部位主要在气络，此时病情变化快，传变迅速[9],对应西医分期为肺泡炎期，以肺泡炎症渗出为主[10]；“久病入络入血”，而随着病情迁延，正消邪长，邪气从浅表之络传入深部至脉络，入络为血络，此时在肺气虚损基础上，虚、痰、瘀共同作用而致络脉痹阻[11-12]，对应西医分期为纤维化期，肺泡间隔纤维结缔组织增生和纤维化形成。因此提出假说：“气络病向血络病的进展过程是肺泡炎期向纤维化期的进展过程”，在治疗上使用扶正剔邪搜络方，麦冬、人参、五味子同用，养阴益气润燥，浙贝母等化痰散结，并针对络病之瘀邪特点，选用虫类药地龙、水蛭等直入血分，搜剔络脉，使干结难破之瘀得化，络痹得开，结邪得去。

Smads蛋白家族是形成肺纤维化过程中信号转导通路过程的重要环节，是公认形成肺间质纤维化的重要通道蛋白质[13]。在肺间质纤维化的不同时相,Smads蛋白表达水平不一，中药组大鼠Smad3、4的表达值明显低于西药组(P<0.05),Smad7表达明显高于西药组(P<0.05)。14，45 dⅢ型胶原中药组表达明显低于模型组。而在肺功能表现上，中药组7 d与模型组无显著变化，14 d时Cl、FVC与模型组比较变化显著,28,45 d Ri、Cl、Fev0.2、FEF25%-75%与模型组比较均有显著变化，相比激素组有较明显优势。Smads蛋白与Ⅲ型胶原表达与肺功能情况吻合，说明扶正剔邪搜络方既可通过影响信号传导通路作用于肺泡炎早期，亦可通过减少细胞外基质的沉积(主要是Ⅲ型胶原)而作用于纤维化期[14-15],而Smads蛋白可能为中药组方起到治疗作用的主要靶点之一，亦从分子水平初步推断肺纤维化相关的气络病向血络病转化过程的物质基础。

研究中发现，7 d激素组肺功能FVC、Fev0.2均明显改善，中药组无明显改善，病理发现中药组第7、14天肺泡炎程度明显轻于模型组(P<0.05),且较激素组轻，与肺功能不符，具体机制尚待进一步研究。

参考文献：

[1]施毅,陈正堂.现代呼吸病治疗学[M].北京:人民军医出版社,2002:427.

[2]RAGHU G,COLLARD H R,EGAN J J,et al.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2011,183(6):788-824.

[3]曹慧芬,王庆文.转化生长因子-β及其Smad信号转导的研究进展[J].中国药物与临床,2010,10(1):1145-1147.

[4]张伟,鲁香凤,张晓梅,等.气管插管快速灌注博莱霉素复制大鼠肺间质纤维化模型[J].中西医结合学报,2008,6(1):60-67.

[5]吕晓东,庞立健.气管内注入博莱霉素致大鼠肺纤维化动物模型方法优化分析[J].实用中医内科杂志,2007,21(2):3-4.

[6]金晓光,代华平,庞宝森,等.博来霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织的动态病理变化及其发生机制[J].中国病理生理杂志,2009,25(4):708-714.

[7]段斐,孔璐,牛建昭,等.鳖甲软肝方治疗大鼠IPF的病理学观察[J].中华实用中西医杂志,2004,4(17):2833.

[8]T H T,BARTON R W,DAMATO D,et al.Differential cellular analysis of bronchoalv eolar lavage fluid obtained at various stages during the development of bleom yeininduced pulmonary fibrosis in the rat[J].The American Review of Respiratory Disease,1982,126(3):488-492.

[9]蒋宁,武维屏.中医络病学说与肺间质纤维化病机关系初探[J].中国中医基础医学杂志,2003,9(5):21-22,26.

[10]崔红生,邱冬梅,武维屏.肺间质纤维化从络病辨治探析[J].中医杂志,2003,44(12):946-947.

[11]武维屏,任传云.肺间质纤维化中医辨治思路[J].中医杂志,2005,46(2):139-141.

[12]武维屏,赵兰才.肺间质纤维化中医证治探析[J].中医杂志,2002,43(5):325-326.

[13]唐志宇,李天朗,唐小宾,等.鳖甲煎丸对肺纤维化大鼠TGF-β1及smad信号通路的影响[J].世界中医药,2011,6(6):522-523.

[14]阴智敏,李宏,张玉英,等.水蛭宣痹化纤汤对博莱霉素大鼠特发性肺纤维化Ⅰ-Ⅲ型胶原表达的影响[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(1):32-34.

[15]郑向鹏,滑炎卿,张国桢,等.Ⅲ型胶原纤维在实验性特发性肺纤维化早期的动态研究[J].上海医学,2002,25(4):205-209.