青贮玉米中10种霉菌毒素LC-MS/MS检测方法的建立和应用

■ 张养东 杨军香 宋孝明 石慧丽 王宗伟 郑 楠 李松励 王加启

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部奶产品质量安全风险评估实验室（北京），北京 100193；2.农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），北京 100193；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；4.全国畜牧总站,北京 100125；5.山东省寿光市畜牧兽医管理局，山东寿光 262700）

霉菌毒素（mycotoxin）普遍存在于青贮玉米饲料中，霉菌毒素能够影响青贮玉米中的营养成分含量及其吸收代谢，降低奶牛采食量和产奶量，抑制奶牛的免疫功能等。如果饲料中含有大量霉菌毒素，奶牛所产的牛奶中霉菌毒素可能超标，人类短期或长期饮用此类牛奶后，会导致疾病或癌症。例如，人们食用含有黄曲霉毒素M1（AFM1，AFB1羟基化）牛奶及其制品后，容易引起肝脏损伤、肝硬化、肿瘤诱导和致突变及免疫抑制等负面作用；黄曲霉毒素能够影响母鼠胎盘的功能，使母鼠的分娩时间提前，小鼠出生重减轻，并容易导致母鼠早产（Wang等，2016）。Alonso等（2013）报道，霉菌污染不仅会造成动物疾病、经济损失，还会影响人类健康，尤其是婴儿健康。2013年度至2015年度对全国1 080个反刍动物养殖点调研发现，反刍动物可见霉菌污染的饲料种类中，青贮玉米是主要的饲料种类。因此，了解和控制青贮饲料中霉菌毒素污染状况，对保证反刍动物食品安全具有重要的意义。

本试验根据青贮玉米饲料的特性，以及10种霉菌毒素的结构特征，改进已有测定猪消化液中霉菌毒素的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法（王瑞国等，2015），建立适用于青贮玉米中10种霉菌毒素检测的LC-MS/MS方法，并使用该方法测定2015年度10个奶牛场的14个全株青贮玉米样品中的霉菌毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、麦角醇、杂色曲霉毒素、HT-2毒素和T-2毒素）含量，以更深入的了解青贮玉米饲料中的霉菌毒素污染情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器

液相色谱-质谱联用仪（Waters Acquily UPLC Xevo TQS），高速冷冻离心机（HITACHI GR22GIII），旋涡振荡仪（Scientific Industries Voter Gnie 2），Mycospin 400多功能净化柱（Romer公司）。

1.1.2 试剂

本试验所用乙腈（Fisher Scientific公司）为色谱纯，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、麦角醇、杂色曲霉毒素、HT-2毒素和T-2毒素标准品（Sigma公司）。其他试剂均为分析纯。

1.2 试样制备和色谱条件

1.2.1 制备青贮玉米提取液

称取(1.00±0.01)g试样于50 ml塑料离心管中，加入8 ml乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1，V/V）进行提取，涡旋混匀1 min，摇床剧烈振荡20 min。提取完成后，以1 000 r/min离心10 min,取1 ml上清液于Mycospin 400多功能净化柱中，收集滤液，放入自动进样瓶中，直接上高效液相色谱串联质谱（HPLC/MS/MS）仪器测定。

1.2.2 制备AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、麦角醇、杂色曲霉毒素、HT-2毒素和T-2毒素储备液和标准工作液

1 mg/ml各霉菌毒素标准储备液：称取10 mg各霉菌毒素标准品分别溶于10 ml乙腈中。10 mg/l的中间混合标准溶液：吸取100 μl各储备液于10 ml容量瓶中，用乙腈定容混匀。工作液用乙腈∶水（50∶50，V/V）稀释混合标准储备液配制。储备液和中间标准混合液在-20℃下冷冻保存，工作液在4℃保存。

1.2.3 色谱和质谱条件

液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 Column,2.1×100 mm,1.8 μm；温度：40 ℃；进样体积：5 μl；流速：0.35 ml/min；流动相A：0.1%甲酸乙腈溶液；流动相B：0.1%甲酸水溶液（见表1）。

表1 流动相梯度

MS条件：多反应监测（MRM）ESI+；离子源温度：150℃脱溶剂气：氮气；雾化温度400℃；毛细管电压：3.00 kV；碰撞气：氩气，流速0.16 ml/min。

2 结果与讨论

2.1 提取过程优化

青贮玉米质地轻、密度低、吸水性比较强，相对于王瑞国等（2015）的报道，添加提取液重量体积比由1∶1增加到1∶4，然后直接用提取溶液上机。

2.2 色谱条件优化

提取溶液中有机相比例较高，用BEH C18的色谱柱DON的溶剂效应较明显，峰形显著低于HSS T3色谱柱（见图1）。

图1 BEH C18色谱柱与HSS T3色谱柱峰形

2.3 质谱条件的优化

以乙腈-水（50∶50，V/V）为流动相，采用结合（Combine）进样方式，对10种霉菌毒素的质谱条件进行优化，在正、负离子模式下进行全扫描，选择合适的准分子离子峰和电离方式。尽管OTA和DON在负电离模式下也有较好的响应，考虑到提取液和流动相中都有甲酸，甲酸有利于正电离的模式下物质的离子化，并且在一次进样检测中，不用通过正负离子模式的切换，这样在大批量样品检测过程可减少仪器的损耗，因此10种霉菌毒素都选用了正离子模式。并结合基质空白和基质标准液的离子扫描图，进一步优化参数确定了各种毒素在多反应监测模式（MRM）下信号采集的特征离子对及质谱条件（见表2）。

表2 质谱参数

2.4 方法的线性范围与定量限

空白样品提取液中添加适量混合标准溶液，按照前处理过程，取1 ml经Mycospin 400净化的提取液，配制浓度为5～100 ng/ml的基质混合标准溶液。根据3倍信噪比（S/N）确定化合物的方法检出限（LOD）；根据10倍信噪比（S/N）确定化合物的方法定量限（LOQ），以浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标做标准曲线，10种组分在正离子模式下均呈良好的线性关系，相关系数（r）均不低于0.998（见表3）。

表3 方法的线性范围与定量限

2.5 回收率和精密度实验

采用空白样品，进行添加回收和精密度实验。样品中添加低、中、高3个浓度梯度的混合标准溶液，每个添加浓度设6个平行，按本实验方法进行样品处理和上机测定，平均回收率为67.4%～114.1%，相对标准偏差（RSD）为0.2%～6.1%（见表4）。

2.6 青贮玉米中的霉菌毒素含量

10个奶牛场14个全株玉米青贮玉米样品检测结果发现，全部检出的霉菌毒素种类为呕吐毒素、黄曲霉毒素B2和玉米赤霉烯酮，河南、河北和山东还检出麦角醇。霉菌毒素含量由高到低依次为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B2和麦角醇（见表5），不过各霉菌毒素含量均未超出国家饲料卫生标准中霉菌及霉菌毒素含量（GB13078-2001、2006、2007）范围。AFB1、AFG1、AFG2、HT-2、T-2、Sterigmatocystin这6种毒素均未检出。

奶牛饲养场的条件不同，造成各家奶牛场原料品质差异极大。从本检测结果看，各奶牛场需要重点关注呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B2。其中呕吐毒素和玉米赤霉烯酮影响奶牛健康、产奶性能与繁殖性能，而黄曲霉毒素则直接影响牛奶品质问题。

3 结语

本文建立了采用乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1，V/V）提取，多功能净化柱净化，HPLC-MS/MS分析法同时测定青贮玉米中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、麦角醇、杂色霉素、HT-2毒素和T-2毒素10种真菌毒素残留的快速检测方法。本方法前处理步骤简单，具有灵敏、快速的特点，分析时间小于7 min，10种霉菌毒素在线性范围内5～100 μg/kg，检出限均小于1.0 μg/kg，均能满足国家对饲料中霉菌毒素限量的要求。

表4 回收率和精密度结果

表5 奶牛场全株玉米青贮样品中霉菌毒素含量(μg/kg)