鼠卡氏肺孢子菌肺炎模型建立及其病理生理学相关细胞因子的变化*

大孙艳　伊丽孜拉·伊克拉木　高剑　陈永杰　赖星星　刘云飞

(新疆医科大学　1.临床医学院2011-2班，2.基础医学院人体寄生虫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

鼠卡氏肺孢子菌肺炎模型建立及其病理生理学相关细胞因子的变化*

大孙艳1伊丽孜拉·伊克拉木1高剑2陈永杰1赖星星1刘云飞1

(新疆医科大学1.临床医学院2011-2班，2.基础医学院人体寄生虫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

【摘要】目的观察大鼠卡氏肺孢子菌肺炎(PCP)模型建立过程中鼠肺组织学、病原学、外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、可溶性粘附分子-1(sICAM-1)和白介素-8(IL-8)含量的动态变化。方法建立大鼠PCP模型，观察建模2、4、6、8和10周时大鼠的发病状况、体重、肺重改变、鼠肺组织学变化、鼠肺印片中卡氏肺孢子菌(PC)包囊形态和增殖数量，并检测大鼠外周血血清中TNF-α、sICAM-1和IL-8的含量。结果建模2周时就可在大鼠肺脏印片中发现PC包囊，但建模6周和8周时PC包囊增殖无显著差异(P>0.05)。建模4周时大鼠出现明显的PCP病征和鼠肺组织学变化，大鼠外周血血清中TNF-α、sICAM-1和IL-8的含量也在建模4周时出现升高，其中TNF-α和sICAM-1升高迅猛，IL-8升高缓慢。结论大鼠建模4周后可出现较为明显的PCP相关病征，而建模6周和8周之间可能存在肺孢子菌与宿主相互作用的相持时期。

【关键词】卡氏肺孢子菌肺炎； 肺孢子菌包囊； 组织学变化； 肿瘤坏死因子-α； 可溶性粘附分子-1； 白介素-8

肺孢子菌原名肺孢子虫/肺囊虫，是免疫低下人群常见并发感染的机会致病性真菌，及其所致的肺孢子菌肺炎( Pneumocystis carinii pneumonia, PCP)已成为艾滋病 AIDS的标志病(marker disease or definiting disease)[1]。通过腹股沟皮下注射地塞米松等免疫抑制剂并结合四环素饮水建立大鼠卡氏肺孢子菌肺炎( Pneumocystis carinii pneumonia, PCP)模型是国内外较为普遍的PCP建模方法[2]。大部分研究都在免疫抑制6～8周后通过随机剖杀实验大鼠，观察鼠肺印片卡氏肺孢子菌包囊的方法来确立模型是否建立成功，但尚无关于大鼠建模过程中PC包囊的出现时间、增殖速率、PCP肺炎的病理变化进程等肺炎指标动态变化的相关报道，大鼠外周血中与PCP肺炎发生相关如TNF-α、sICAM和IL-8等细胞因子的含量在PCP建模过程中的动态变化也无详细的监测报道，故本研究以2周为实验时间跨度，动态监测上述指标在大鼠PCP肺炎建模过程中的变化。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级雌性Sprague-Dawley( SD) 大鼠40只[新疆医科大学动物实验中心, 合格证号: XCXK(新)2011-04],体重180～220g。购入后适应性饲养1周。

1.2主要试剂地塞米松磷酸钠注射液(郑州卓峰制药有限责任公司)；四环素片(四川锦华药业有限公司)；姬-瑞氏染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司；大鼠白介素-8(IL-8)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒、可溶性粘附分子-1(sICAM-1) ELISA试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。

1.3PCP大鼠模型的建立SD大鼠每周2次腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠注射液3.5 mg/只·次，同时在饮用水中加入1mg/ml四环素以预防继发性细菌感染。连续注射8周,注射停止后持续饲养并观察2周。大鼠在实验过程中以普通级饲料颗粒喂养，勤换垫料，并定期以紫外光灯照射和消毒液擦地等方法保证动物饲养环境的清洁。

1.4对照大鼠的实验处理SD大鼠以腹股沟皮下注射生理盐水的方法设立正常对照组，饮用水中不加四环素，饲养条件和环境同模型组大鼠，但与模型组大鼠分室饲养以杜绝交叉感染。

1.5观察指标及方法

1.5.1大鼠一般情况观察实验过程中随时观察大鼠的呼吸、活动和摄食情况，记录存活数、每2周称量体质量并随机剖杀6只感染组大鼠，取全肺, 称全肺湿重, 记录各鼠肺重, 计算肺重/体重比。

1.5.2鼠肺组织学观察大鼠剖杀后取完整肺组织，肉眼观察肺脏大小、颜色、质地及肺表面有无明显病灶等变化；取病灶肺组织制作常规石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色并在光镜下观察鼠肺组织学改变。

1.5.3鼠肺病原学观察无菌取肺组织切开肺叶，制作肺印片，自然干燥后甲醇固定，姬-瑞氏染色,油镜观察PC包囊形态并计数。包囊计数方法参看文献[3]: 印片置尼康系列电子显微镜下观察并用NIS-Element摄像软件拍照，每张印片油镜下随机观察20个视野, 计数PC包囊总数, 然后计算每只大鼠20个视野的包囊总数均数, 再计算每组大鼠20个视野包囊总数均数。

1.5.4大鼠血清细胞因子含量测定建模大鼠每2周腹主动脉无菌采血，室温下静置1小时， 2000r/min离心10min, 分离血清，-20℃冻存待测。对照组大鼠于实验10周时，同上方法采集血清待测。以ELISA双抗夹心法分别测定各血清样品中TNF-α、sICAM-1和IL-8的含量，包被板中分别设立各浓度梯度细胞因子标准品样孔和TMB对照孔，严格按照试剂盒说明书操作，用BIO-RAD公司Xmark酶联免疫检测仪在450nm处测吸光值。以各浓度梯度标准品为横坐标，OD值为纵坐标，使用Microplate Manager6.0软件绘制标准曲线。根据样品OD值计算出血清样品中相应细胞因子含量，结果以pg/ml表示。

1.6统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计处理。不同建模时间大鼠组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠一般状况大鼠建模第4周开始出现反应迟钝、摄食减少、毛色灰暗等症状，随建模时间延长，体毛蓬松并发生斑块状脱毛；眼球逐渐由透亮的粉红色变浊、变暗，伴炎性分泌物；呼吸急促，鼻腔中分泌物增多。至建模10周，40只大鼠累计死亡5只，死亡率为12.5%，大鼠死亡主要发生于6～8周之间；建模过程中大鼠体重持续减轻(图1)，体质量变化有统计学意义(P<0.05)。

图1PCP大鼠体重变化

Figure 1The average weight of PCP rats

2.2大鼠肺重和肺重/体质量比随建模时间延长，大鼠发生肺重增加，肺重/体质量比值逐渐增大的现象，但建模6～8周间肺重/体质量比值变化无显著性差异(P>0.05，表1)。

2.3大鼠肺组织病理学变化

2.3.1肉眼观察建模4周时有大鼠开始出现肺组

Table 1The average Lung weights and Lung weight/body weight ratio of rats

建模时间(周)平均肺重(g)肺重/体重比值(×10-2)01.76±0.140.85±0.0422.34±0.141.10±0.06①42.57±0.451.35±0.01①62.93±0.351.61±0.05②82.97±0.311.64±0.14②103.47±0.192.06±0.10①

注: 与建模0周相比, ①P<0.05;建模6～8周组间比较, ②P>0.05

织小区域肿胀、质硬、淡红色等变化，且主要发现于体质量减轻较快的大鼠；随建模时间延长，肺脏表面逐渐发现点状或斑片状灰白色或黄色病灶, 挤压时病灶处有粘稠性渗出物；至建模10周时有些大鼠肺脏表面出现弥漫白色针尖样或点状结节，质硬(图2)。

2.3.2肺组织切片观察正常大鼠肺组织肺泡壁完整，肺泡腔干净透亮, 肺间质细胞排列紧致无充血水肿；建模组大鼠肺脏组织随建模时间延长呈渐进性变化，建模6周前主要表现为有些区域出现肺泡壁断裂及肺泡腔的融合，肺泡腔内充满粉色泡沫样渗出物；建模6周后则以肺纤维化改变为主，肺间隔逐渐增厚，肺泡腔融合闭陷，有些区域所有肺泡腔均闭陷形成严重肺实变(图3)。

图2大鼠肺脏肉眼改变

Figure 2 Changes in the lungs of PCP rats by naked eye

注:A.建模6W时大鼠肺脏表面黄色病灶(↑)；B.建模10W时大鼠肺脏弥漫性白色点状结节

图3PCP大鼠肺脏组织学变化(HE, ×200)

Figure 3Histological changes in the lungs of PCP rats (HE, ×200)

注:A. 正常SD大鼠肺脏组织；B.建模2周大鼠肺脏组织(↑：泡沫样渗出物)；C. 建模4周大鼠肺脏组织；D. 建模6周大鼠肺脏组织(肺纤维化)；E. 建模8周大鼠肺脏组织；F. 建模10周大鼠肺脏组织(肺实变)

2.4大鼠肺脏印片PC包囊形态及增殖变化每2周随机剖杀6只建模大鼠取新鲜肺组织印片，姬-瑞氏染色后油镜下观察(图4)：建模2周时即在大鼠肺脏印片中发现PC包囊，包囊直径6～8μm，经姬-瑞氏染色后囊壁不着色，囊内子孢子呈紫蓝色，新月形或圆形，排列不规则；PC包囊在鼠肺中有聚集增殖的特点，肺门处菌体较集中，有些区域则完全无感染；随建模时间延长，肺印片中PC包囊逐渐增多且分布弥散，建模6周和8周时增殖变化无统计学意义(P>0.05)，但形态变化有差异：建模6周时PC菌体较小，囊内子孢子凑缩在一起；建模8周时菌体增大，囊内子孢子形态大而清晰，排列不规则；不同建模时间大鼠肺脏印片中PC包囊计数结果(图5)。

2.5大鼠建模过程中外周血清TNF-α、sICAM-1和IL-8含量变化 建模4周前大鼠外周血中TNF-α和sICAM-1出现轻微升高，4周后则迅猛升高，至建模

图4PCP大鼠肺脏印片中PC包囊形态(姬-瑞氏染色, ×1000)

Figure 4Morphology of PC cysts in lung printing of PCP rats (Giemsa - Wright’s stain, ×1000)

注：A. 建模2周大鼠肺脏印片(↑：PC包囊)；B. 建模4周大鼠肺脏印片；C. 建模6周大鼠肺脏印片；D. 建模8周大鼠肺脏印片

图5PCP大鼠肺脏印片中PC包囊增殖变化(个)

Figure 5Proliferation changes of PC cysts in lung printing of PCP rats

图6PCP大鼠外周血清TNF-α、sICAM-1和IL-8水平变化(pg/ml)

Figure 6The level changes of TNF-α, sICAM-1 and IL-8 in sera of PCP rats

10周时大鼠血清中TNF-α已达到建模前的6倍，sICAM-1已达建模前的20倍；建模4周时大鼠外周血清中IL-8较建模前略有降低，建模4周后缓慢升高(图6)。

3讨论

鉴于伊氏(耶氏)肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci Frenkel，1999)和鼠源性卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii, PC)在病原学形态、核酸和抗原等方面存在的共性[3]，SD大鼠卡氏肺孢子菌肺炎模型已成为人肺孢子菌肺炎的经典动物模型，常用于病理机制的探索和药物的研发。本研究以2周为时间跨度，分5个时间点动态监测了PCP大鼠建模过程中PCP肺炎的病情发展和鼠肺内PC包囊的增殖状态，发现大鼠PCP肺炎发生的各项观察指标，既有渐进性变化，又有特殊的发生特点。

PC包囊存在于日常空气环境中，对免疫正常的人体或动物通常呈隐性感染，即以常规病原学检查方法查不到肺脏组织中的病原体。以免疫抑制方法建模2周后鼠肺印片中个别区域就可发现PC包囊，而大鼠摄食、呼吸、活动的异常，肺脏肉眼和组织学变化均发生于建模4周后，提示大鼠免疫功能的下降是PCP发生的先决条件，鼠肺中PC包囊的增殖必须伴随大鼠免疫功能的进一步下降，才能发生PCP相关的各种病理变化。

肺泡内渗出和肺实变是PCP肺炎最典型的组织学改变，肺泡腔内的泡沫样渗出物主要为坏死虫体和免疫球蛋白的混合物，伴随肺泡腔内渗出现象的增多，同步发生肺泡上皮增生增厚和肺间隔的增宽，从而出现肺纤维化，最终肺泡间隔可增厚至正常肺间隔的5～20倍，占据整个肺容积的3/4，肺脏发生大面积实变，使大鼠发生严重的呼吸窘迫和机械通气障碍。研究表明，PCP大鼠肺脏病理变化并不是肺孢子菌的单独作用，而是由众多种类的呼吸道病毒(rat respiratory virus，RRV)累加感染所致[4]，提示PCP是一种基于肺孢子菌增殖改变肺脏环境而由多种病原引起的免疫病理损伤。本研究所观察到的PCP大鼠肺组织学变化与2006年周永华等[5]报道中所观察到的基本一致，但也发现不同部位肺组织的变化速率并不相同，即使建模10周时，在鼠肺中依然可见正常肺组织形态，有些区域的组织学变化也以肺泡腔内泡沫样渗出现象为主，肺组织变化并不均一，推测与PC包囊在肺脏不同区域中的分布有关。

大鼠肺重、肺重/体重比值、鼠肺印片PC包囊增殖变化等指标在建模6和8周之间均无统计学差异，推测建模6和8周之间可能存在肺孢子菌与宿主相互作用的相持时期。PC包囊在鼠肺中仅限寄生于肺泡腔中，而建模6和8周之间鼠肺印片中包囊数量无显著增加，结合大鼠肺组织学的动态变化，推测鼠肺间隔不断增厚使肺泡腔闭陷可能局限了PC包囊的增殖空间，使PC包囊的发育主要表现为囊内子孢子的成熟。 但也不排除部分PC成熟包囊破裂子孢子逸出后发育为滋养体，使包囊数量表现为无增加的可能。国外研究表明，肺孢子菌的生命周期状态依据机体寄生环境中的营养支持而不同，存在经染色体融合而形成的二倍体状态，或者无性有丝分裂形式，或者二者共存[6]。提示由于目前尚无成熟的PC包囊体外培养方法，即使采用完全相同的动物模型建立方法，也无法判断鼠肺中PC包囊和滋养体的增殖状态。

TNF-α、IL-8和黏附分子sICAM-1均是 PCP 特异性细胞免疫中重要的炎症介质，在参与介导炎症反应、免疫调节等方面有着重要的作用[7]。三种细胞因子参与PCP感染的发生主要通过PC激活巨噬细胞产生TNF-α，参与 PCP 的免疫病理反应。而TNF-α可进一步增加巨噬细胞等免疫细胞IL-8 和sICAM-1的表达， IL-8和sICAM-1又可促进白细胞黏附聚集在肺部组织，破坏局部免疫系统，使虫体大量附着，进而导致肺泡气体交换障碍[8]。 也有研究表明， PC包囊可活化气道上皮细胞中的肺细胞壁β葡聚糖(Pneumocystis cell wall β-glucans, PCBG)，进一步诱导MAPK、ERK和p38的磷酸化，从而激活经NF-κB和钙依赖性途径对IL-8的分泌[9]。

本研究发现，建模4周前大鼠血清中这三种因子水平的变化比较轻微，其中血清中IL-8甚至有降低的现象，推测大鼠血清中上述三种细胞因子的含量变化在建模4周前系皮下注射地塞米松破坏大鼠免疫系统功能所致，而建模4周后的含量变化才反应大鼠体内PCP的严重程度，其中TNF-α和sICAM-1迅猛上升，提示感染随建模时间延长而加重，而IL-8缓慢升高，与万启惠等[10]发现卡氏肺孢子虫肺炎大鼠血清中IL-8含量在建模第7、8、9周有轻微升高的观察结果一致，推测IL-8在PC包囊激起的免疫应答过程中可能属于后效应因子。综合观察上述三种因子的含量变化，可帮助判断机体内PCP的严重程度。

4结论

本研究结果显示，大鼠建模4周后可出现鼠肺组织学改变和血清中细胞因子含量变化等较为明显的PCP相关病征，而建模6周和8周之间可能存在肺孢子菌与宿主相互作用的相持时期。通过对免疫低下人群上述指标进行动态监测并及时给予药物防控，可能对降低AIDS等免疫低下人群中PCP的发生起到一定作用。

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Modeling of pneumocystispneumonia in rats and the change of pathophysiological cytokineSUN Yan1, Yilizila·Yikelamu1, GAO Jian2,etal

(1.Class2011-2,ClinicalMedicalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;

2.DepartmentofHumanParasitology,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,Urumqi830011,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the dynamic changes of pulmonary histology, pathogenic, and content of TNF-α, sICAM-1 and IL-8 in serum in rats during the establishment of pnenmonia model for pnenmocystis carinii. MethodsThe pnenmonia model for pnenmocystis carinii in rats was established. The changes of rat weight, lung weight and lung histology and morphology and number of pnenmocystis carinii cysts in rats 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks,8 weeks, and 10 weeks after establishment were observed. TNF-α, sICAM-1 and IL-8 in serum in rats were measured. ResultsThe cysts of pnenmocystis carinii were found in lung printing of rats as early as 2 weeks after PCP model established, but no significant differences of proliferation of PC cysts were found between 6 weeks and 8 weeks after PCP model established 6 weeks and 8 weeks. The symptoms and histological changes of PCP obviously appeared 4 weeks after PCP model established. The content of TNF-α, sICAM-1 and IL-8 in serum in rats also significantly increased 4 weeks after PCP model established, while the content of TNF-α and sICAM-1 increased rapidly compared that of IL-8. ConclusionAll PCP-related symptoms can be observed 4 weeks after PCP model established, and a stalemate stage of pneumocystis-host interaction may existed between 6 weeks and 8 weeks after PCP model establishment.

【Key words】Pneumocystis carinii pneumonia; Cysts of pnenmocystis carinii; Histology; TNF-α; sICAM-1; IL-8

(收稿日期：2015-02-03； 编辑： 母存培)

通讯作者：高剑，E-mail：gaojian5101@163.com

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201310760002)；新疆医科大学大学生创新性实验计划项目(CX2013002)；新疆医科大学博士(后)科研项目启动基金并新疆医科大学科研创新基金(XJ201222)

【中图分类号】R-33

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.09.003