束缚应激所致小鼠脑区的神经递质和行为改变及运动干预效果

马磊　黄文英　杨念恩　肖晓玲　孙飙　康学军

摘 要：为了探讨束缚应激对小鼠神经递质、行为的影响及有氧运动的干预效果。选用1月龄C57BL/6小鼠80只，随机分为4组：控制组（Control，n=20只）、束缚应激组（Stress，n=20只）、运动组（Ex，n=20只）、运动束缚应激组（Stress+Ex，n=20只）。控制组安静饲养，束缚应激组进行2周的束缚应激，运动组每天进行2 h跑台锻炼，运动束缚应激组同时进行束缚应激和跑台锻炼。结果发现：行为试验中，束缚应激组小鼠社交行为显著下降、焦虑及抑郁行为水平发生显著上升（P<0.05），而运动干预能够缓解束缚应激对这些行为的影响。生化指标同样说明有氧锻炼有效缓解了束缚应激导致的行为和单胺类神经递质的改变。结果说明：束缚应激会导致社交及情绪相关行为的改变，而运动干预会起到有效的缓解作用。

关 键 词：运动生理学；束缚应激；运动；社交行为；单受神经递质；小鼠

中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2015）06-0133-06

Abstract： In order to probe into the effects of restrained stress on monoamine neurotransmitters and behaviors of mice as well as aerobic exercise intervention effects， the authors selected 80 1-month old C57BL/6 mice， randomly divided them into 4 groups： a control group （Control， n=20）， a restrained stress group （Stress， n=20）， an exercise group （Ex， n=20） and an exercise + restrained stress group （Stress + Ex， n=20）， fed the control group in a calm condition， let the restrained stress group suffer restrained stress for 2 weeks， let the exercise group exercise on a treadmill 2 hours a day， let the exercise + restrained stress group suffer restrained stress and exercise on a treadmill simultaneously， and revealed the following findings： in the behavior experiment， the mice in the restrained stress group had significantly decreased social behaviors and significantly increased levels of anxiety and depression behaviors （P<0.05）， while exercise intervention could alleviate the effects of restrained stress on these behaviors. Biochemical indexes indicated as well that aerobic exercise effectively alleviated retrained stress induced changes of behaviors and monoamine neurotransmitters. Conclusion： restrained stress will cause changes of social communication and emotion related behaviors， while exercise intervention will play an effective role of alleviation.

Key words： sports physiology；restrained stress；exercise；social behavior；monoamine neurotransmitter；mouse

持續压力会造成人或者动物改变社交习惯、降低认知能力，甚至产生抑郁或者焦虑等情绪失调[1]。因此，探索压力应激对个体脑及行为塑造作用机制对保障人类身心健康具有重要意义[2]。束缚应激是广泛使用的模拟人类生活压力应激的动物模型之一[3-4]。束缚应激会影响动物的多种行为学和生物学指标，其中包括对学习和记忆等认知方面的损害、社交互动行为的改变[5]。急性束缚应激会使机体产生负性情绪，造成脑部的海马神经元损伤，树突棘和增生物增加[6]。慢性束缚应激因改变HPA轴的敏感性而造成行为的改变。大量研究发现，伴随着大脑皮层、海马及外周血中儿茶酚胺神经递质及代谢物含量的改变，慢性束缚应激会显著降低实验动物的认知功能[7]。束缚应激会造成神经内分泌改变，包括儿茶酚胺的降低及皮质酮应激反应敏感性下降。这种神经内分泌的改变与神经元中五羟色胺受体功能和表达的上升及五羟色胺神经递质分泌的改变相关。慢性应激会使杏仁核中的神经元极度活跃，造成相对应神经元的损伤[8-9]。而动物研究表明，运动可调节多种神经递质系统，如五羟色胺（5-HT）[10-11]、多巴胺（DA）[12]、去甲肾上腺素（NE）[13]及它们的代谢产物，进而会起到积极的干预作用。

虽然束缚应激对神经递质及行为影响的研究多见报道，但是运动对慢性束缚应激干预效应和机制研究相对较少[5]。因此，本研究用小鼠慢性束缚应激模型考察运动干预效果，探索其作用机制。

1 实验材料和方法

1.1 试剂与仪器

1）去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）购自美国Sigma公司，纯度≥

98.0%；乙腈：色谱纯，采用美国FisherScientific公司产品；高氯酸、碳酸氢钾、冰醋酸等均为分析纯，南京化学试剂有限公司产品；实验用水为自制二次重蒸水。

2）LC.10AD vp高效液相色谱仪、SPD-10AD vp荧光检测器、色谱柱为岛津Shim-pack VP-ODS的CTs液相色谱柱（150 ibm×4.6 mm×5 μm）（日本岛津公司）；GL.88B旋涡混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；电恒温水浴装置（江苏光都机电设备有限公司）；ANY-Maze 动物行为分析系统（美国Stoelting公司）。

1.2 实验动物和实验设计

C57BL/6小鼠（3周龄）购于北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠养在通风的隔笼里，室温为20～25 ℃，相对湿度60% ，光暗周期为12 h，保持安静，食物和水按时提供。在正式实验前所有小鼠均预先适应1周并且每天都进行小鼠称重。80只小鼠随机分成4组，每组20只，控制组（n=20只），束缚应激组（n=20只），运动组（n=20只），运动束缚应激组（n=20只）。具体实施方案如下：适应性喂养1周，束缚应激为每天上午10：00开始持续120 min，跑台锻炼时间为下午18：00持续30 min，每周训练5 d，共2周。束缚应激方法：取50 mL圆柱形离心管（管底留一个3 mm半径小孔），将小鼠放在只能容纳小鼠整个躯体的管子中，将管子放在同一房间的不同笼子中，放置时间是上午09：00—11：00。跑台锻炼方法：进行平坡的跑台运动，速度0.8 km/h，坡度为0°，实验开始前1天下午18：00对小鼠进行一次15 min的适应性训练，然后第2天按上述运动方案训练。其中运动束缚应激组同时进行束缚应激和运动干预；束缚应激组只束缚应激；运动组只运动干预；控制组与其它组小鼠一起饲养，无运动干预和束缚应激。所有动物实验均遵循东南大学伦理委员会指导文件操作。

1.3 指标检测

1月龄小鼠正处于青少年期，为了研究是否束缚应激会导致焦虑、抑郁以及社交行为的改变。在两周实验完成后，依次进行社交行为实验，高架十字迷宫、新奇-抑制摄食试验以及强迫游泳实验来验证小鼠的焦虑和抑郁水平及运动干预对小鼠这些行为的影响，行为实验结束后，平衡24 h后处死并迅速检测不同脑区单胺类神经递质水平。

1）社交行为实验。

社交行为实验采用包含有3个相同大小的房间（40 cm×40 cm×20 cm）的社交行为观察室，中间为空房间并有通向两侧房间的通道，两侧房间分别各放1个鼠笼。实验小鼠分两类，一类为社交行为专用陌生小鼠（stranger），而另一类为实验鼠。测试选用2只社交行为专用陌生小鼠1和2，均为雄性，年龄、体重相近，同实验小鼠品系相同且实验前没有接触过的小鼠。

用不透明的树脂玻璃板隔离左右侧两个房间。实验开始前将实验鼠放入行为观察箱的中间房间适应5 min，期间将陌生小鼠随机放入一侧房间的鼠笼中。实验小鼠可以同陌生小鼠隔着鼠笼相互嗅探，但无法进行肢体接触。正式实验开始时移去隔离板，通过动物行为分析系统分别记录10 min内实验小鼠同空鼠笼或陌生小鼠的互动时间和房间逗留时间。互动时间=实验小鼠直接接触鼠笼+距2 cm内直立嗅探的时间。实验小鼠在每个房间的逗留时间以每只小鼠头和四肢均进入房间后为准。实验结束后将实验小鼠取出、归笼。每次实验后用体积分数为70%酒精清洁整个测试装置以备下一个实验。具体过程见图1。

如图1所示，笼中的为陌生小鼠，笼外的为实验小鼠，社交行为实验前后包括两个阶段：第1阶段同时记录（A）实验小鼠在陌生小鼠1或空鼠笼所在房间的逗留时间和（B）实验小鼠同空鼠笼或陌生小鼠1互动的时间；第2阶段为（C）实验小鼠在陌生小鼠1或陌生小鼠2所在房间的逗留时间和（D）实验小鼠同陌生小鼠1及陌生小鼠2互动时间。

2）高架十字迷宫实验。

将小鼠放在十字迷宫正中间，高度距离地面1 m，两边为封闭臂，另两边为开放臂。用电子路径系统记录小鼠停留在开放臂和封闭臂的时间以及路径。迷宫需用体积分数为70%的乙醇和水清洗、干燥无味后进行下一只动物实验。

3）新奇-抑制摄食试验。

小鼠剥夺饮食一段时间后，分别放在旷场实验箱（60 cm×60 cm×30 cm）里。将，1粒球状鼠粮置于实验箱底的中心，每只小鼠放于实验箱底的角落，自由活动12 min。记录每只小鼠第1次吃到食物的时间，分别记录测试结束后30 min内每只小鼠在笼中的饮食情况。

4）强迫游泳实验。

将小鼠放在水桶的中心（水温24～25 ℃；水桶半径20 cm，高40 cm） 10 min。小鼠无法接触水桶的底部。小鼠的行為通过视频路径监控系统自动记录。仪器自动记录小鼠的潜在不动的时间及最后4 min的挣扎时间（四肢强烈挣扎、划擦水桶壁）。

5）小鼠取材。

每只小鼠称重后随机分组，每周一下午18：00锻炼前，用电子天平（JZC-XXC，上海亚津科技有限公司）称量各组小鼠体重。行为测试结束后静置24 h，断颈椎处死，迅速剥离不同脑区并取血，脑组织样品称重，加入50 μL用冰预冷的0.1 mol/L高氯酸（含10-7 mol/L维生素C）用微量匀浆机匀浆，匀浆液再5 200×g离心（4℃） 30 min，然后用0.22 μm滤膜过滤并将10 μL滤液用990 μL蒸馏水稀释到1 mL，吸取20 μL稀释液注射到色谱仪进行分析，其他样品迅速置于-80℃保存。

6）单胺类神经递质及其代谢物检测。

小鼠脑部的单胺神经递质及其衍生物采用高效液相色谱荧光检测法：采用ESA MD-150色谱柱（150 mm×3.2 mm，2.0 ?m），C18预柱（10 mm×3 mm，3 ?m）。激发波长为345 nm，发射波长为480 nm；流动相选择：用0.45 μm的微孔滤膜过滤，超声脱气乙腈和15 mmol/L醋酸盐缓冲液（pH4.7；35︰65，体积比）流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：20 μL[14]。

7）数据统计。

所有数据均录入SPSS18.1统计软件，并通过方差分析统计束缚应激以及运动干预的作用。

2 结果与分析

2.1 束缚应激造成的社交行为倾向与运动干预效果

如表1所示，应激组小鼠与陌生小鼠1互动的时间较控制组非常显著降低（P<0.01）。运动组小鼠与空笼接触的时间显著上升（P< 0.05）。应激组小鼠在装有陌生小鼠1房间角落区的停留时间非常显著上升（P<0.01）。该实验结果表明束缚应激小鼠社交行为显著低于其他组（P<0.05），而代表焦虑抑郁相关行为的角落区停留时间非常显著高于其他组（P<0.01）；运动组及运动束缚应激组小鼠社交行为以及焦虑抑郁相关行为同控制组比较无显著性差异。

如表2所示，应激组小鼠与陌生小鼠1和陌生小鼠2互动的时间非常显著低于其他组（P<0.01），说明应激损害小鼠社交能力。运动组小鼠与陌生小鼠1互动的时间显著高于控制组（P<0.05）。运动束缚应激组小鼠与陌生小鼠1和陌生小鼠2互动的时间显著高于控制组（P<0.05），说明运动干预可能会缓解束缚应激造成的社交行为的下降。应激组小鼠停留在陌生小鼠1和陌生小鼠2所在房间角落的时间均非常显著高于其他组（P<0.01）。而运动组小鼠停留在陌生小鼠1和区域的时间同控制组没有显著性差异。结果说明应激增加了社交行为过程中焦虑相关行为，降低了社交行为；而运动则降低了应激对社交行为的影响。

2.2 束缚应激导致的焦虑和抑郁行为的运动干预效果

1）十字迷宫实验结果。

如表3所示，束缚应激组在开放臂中花费的时间及进入开放臂中的次数均显著下降（P<0.05）。而运动组及运动束缚应激组与控制组没有显著性差异，说明束缚应激增加了小鼠的焦虑行为，而运动降低了这种焦虑相关行为。

2）新奇焦虑抑制摄食试验结果。

如表4所示，束缚应激组相比控制组摄食潜伏期显著提高（P<0.05）；摄食数量均显著降低（P<0.05）。束缚应激显著提高了饮食的潜伏期，测试中进食数量也显著下降，与本研究的预期一致，运动干预减轻了束缚应激导致的新奇摄食抑制行为的改变。而运动干预却没有改变正常饮食行为。实验组和控制组之间在进食总量上没有显著性差异。

3）强迫游泳实验结果。

为了验证束缚应激对小鼠抑郁相关行为影响的程度，本研究采用了强迫游泳实验。结果表明束缚应激显著降低了小鼠的无动时间（见表5）。

如表5所示，运动可能降低了束缚应激造成的抑郁行为，强迫游泳试验中，束缚应激小鼠放弃游泳的时间和最后4 min的挣扎时间相对于控制组和运动组均降低。总的来说，实验结果说明束缚应激增加了动物的焦虑与抑郁，而长期给予运动能够减轻动物不正常情绪的改变。

2.3 束缚应激对不同脑区单胺神经递质及其代谢物的影响及运动干预效果

为了寻找行为改变的相关神经内分泌证据，检测了小鼠不同脑区单胺神经递质及其代谢物的水平，结果如表6。

表6说明了束缚应激和运动及运动结合束缚应激对小鼠不同脑区的单胺类神经递质及其衍生物的影响。具体结果如下：

1）单胺类神经递质在小鼠皮层中变化。

分别对实验组及对照组（控制组）小鼠脑中各单胺类神经递质含量进行检测，发现应激组小鼠皮层中5-HT、5HIAA和NE的质量分数都较对照组小鼠显著降低。而运动组单胺类神经递质的质量分数相对于对照组都出现上升（5HT、NE），运动束缚应激组小鼠只有DA、5HIAA的下降具有统计学意义。

2）小鼠海马中单胺类神经递质水平升高。

如表6所示，与对照组相比，应激组小鼠海马中5-HT、DA、E和NE的质量分数均显著下降，而运动组5-HT和5HIAA的质量分数显著上升，与皮层中神经递质质量分数的变化呈现出不同的规律。

3）小鼠前脑其他部位单胺类递质的变化。

对杏仁核部位的单胺类递质质量分数进行检测发现，应激组小鼠中5-HT显著降低、5HIAA显著上升。运动使小鼠DA 和5-HT水平显著上升，运动束缚应激组杏仁核单胺神经递质质量分数无统计学意义。单胺类神经递质在前脑其他区域呈现出与皮层、海马均有不同的变化趋势。

3 讨论

束缚应激是模拟人类生活压力改变人类社交、情绪及认知等多种行为最常见的动物模型。同时，束缚应激也是广泛应用的应激障碍疾病动物模型，不但可以模拟免疫下降、认知功能下降，还可以使小鼠产生焦虑及抑郁等症状[9]。越来越多的证据说明，束缚应激对脑具有塑造作用，这种塑造作用可以表现為基因、神经内分泌及行为学的改变。应激将单胺类递质系统激活后，会对神经网络结构产生影响，因此重复应激会使机体对应激产生适应。

在应激状态下，实验动物的脑内可出现5-HT更新速率增加，使HPA轴过度亢进或功能不足，进而导致5-HT浓度改变。急性应激使皮层、海马，及杏仁核5-HT和其代谢产物5-HIAA的含量显著增加；慢性应激皮层5HT及5-HIAA逐渐恢复到或低于应激前水平。大鼠在3 h急性运动后[15]或8周跑台运动后[16]，大脑5-HT的水平都升高。微透析研究发现，60 min跑台运动后，大鼠海马的5-HT水平升高[13]。另外，研究表明，大鼠兴奋水平与脑内DA释放成正相关，重复应激后动物海马DA水平降低。运动使大鼠前额皮质、海马和纹状体的DA水平及其代谢物水平都有所增加[17]。因此，之前的研究似乎表明海马神经元与情绪的兴奋、抑制平衡有关系。

在本研究中，对应激组被试小鼠不同脑区中单胺类递质检测发现，5-HT、DA及NE在大部分腦区中含量均有所降低，部分结果与之前的研究结果相一致[18]，说明束缚应激是易复制的应激动物模型。第1，本研究证明了束缚应激可以使小鼠焦虑和抑郁行为增加；第2，本研究的结果同样发现束缚应激降低了小鼠社交行为；最后，本研究发现束缚应激使小鼠不同脑区大多数单胺类神经递质水平下降。总的来说，本研究结果与之前束缚应激小鼠模型结果相一致，证明本束缚应激模型成功复制模拟压力影响个体行为倾向性的模型。

同时，本研究发现小鼠束缚应激后会出现社交互动行为下降、焦虑及抑郁水平增加的情况。这些行为的改变可能与不同脑区抑制性与兴奋性单胺类神经递质失调相关[19-20]。更重要的是，运动干预可以缓解束缚应激后的焦虑抑郁相关行为、单胺类神经递质及其代谢物水平的改变。这些结果说明周期为2周、每天2 h的慢性束缚应激可能会使小鼠产生适度的焦虑抑郁行为，而运动干预却降低了束缚应激产生的这种变化[21-22]。

大量研究证明运动可以用来缓解压力造成的负性情绪及行为，提高认知功能。在前期研究的基础上，本研究用运动干预的方法来缓解压力造成的焦虑、抑郁及社交相关行为的改变。本研究结果说明运动缓解了应激造成的多种行为学及生物学的变化。部分结果与之前的相关研究结果不一致[10]，有待进一步深入研究。

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