P16 在胆汁反流性胃炎、胃癌组织中的表达及意义

徐晓玲，徐永居，王 璐，陈 洁，王翠梅，曹 丽，凡兰桂，沈 琴，朱海杭

江苏省苏北人民医院＆扬州大学临床医学院1.消化科;2.病理科，江苏 扬州225001

胆汁反流性胃炎是慢性胃炎中一种较常见的类型。胆汁反流可致胃小凹上皮增生，Dixon 等［1］通过病理研究发现，胆汁反流可能与胃窦黏膜肠上皮化生有关。但其对胃上皮细胞生长的影响尚不明确，其是否属于癌前病变，与胃癌的关系需要进一步研究探讨。P16 是细胞周期的负向调控因子，在细胞周期调控中作用突出，它已成为肿瘤诊断的有前景的参考指标。有研究表明，P16 基因缺失是胃癌发生的早期事件。胃癌发生、发展过程中可能有P16 基因的变异［2］。本研究通过检测正常胃黏膜、胆汁反流性胃炎、癌旁组织、胃癌中的P16 表达水平，探讨胆汁反流性胃炎与胃癌的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2012 年6 月-2013 年12月江苏省苏北人民医院病理科存档的胃癌标本51 例，男27 例，女24 例，年龄18 ～79 岁，平均年龄(54.1 ±12.1)岁。同时取癌旁组织49 例(距离肿瘤组织边缘3 ～5 cm)，男25 例，女24 例，年龄21 ～78 岁，平均年龄(55.5 ±11.4)岁。另随机选取同期于消化内镜中心诊断的胆汁反流性胃炎组织标本52 例，男28 例，女24 例，年龄22 ～76 岁，平均年龄(51.1 ±12.5)岁。正常胃黏膜(即健康体检者，胃镜提示为浅表性胃炎，内镜下观察无出血、糜烂等表现)组织标本48 例，男21例，女27 例，年龄19 ～69 岁，平均年龄(51.2 ±10.8)岁。各组患者的年龄、性别等方面比较，差异均无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 免疫组织化学:(1)蜡块切片，68 ℃烤片20 min，常规脱蜡，梯度酒精脱水;(2)热抗原修复采用微波法。微波炉高档加热pH =6 的柠檬酸缓冲液1 ～2 min使温度升至96 ℃左右，切片置于塑料架中放入缓冲液中，微波炉高档20 min(96 ℃)，取出切片自然冷却至室温;(3)滴加3% 过氧化氢去离子水，37 ℃孵育10 min;(4)PBS 冲洗2 min ×3 次;(5)滴加一抗，4 ℃冰箱过夜，PBS 冲洗2 min ×3 次;(6)滴加Polymer Helper，37 ℃孵育20 min，PBS 冲洗2 min ×3次;(7)滴加Poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育20 min，phosphate buffered saline (PBS)冲洗2 min ×3次;(8)DAB 溶液显色(1 ml DAB 底物缓冲液中滴加1 滴DAB 浓缩液);(9)蒸馏水充分冲洗、苏木素复染、脱水、透明、干燥、封片，PBS 代替一抗作为阴性对照。P16 兔抗人单克隆抗体、兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒及DAB 试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 观察指标 P16 蛋白的阳性判断参照Geradts等［3］的诊断标准。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 软件进行分析，计量资料用率表示，采用χ2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16 在胃癌及胆汁反流性胃炎中的表达 P16蛋白在胃癌中的阳性表达部位在细胞核。P16 蛋白在胆汁反流性胃炎中的阳性表达部位在细胞核(见图1 ～2)。

图1 P16 蛋白在胃癌中的表达(SP 400 ×);图2 P16 蛋白在胆汁反流性胃炎中的表达(SP 400 ×)Fig 1 Expression of P16 protein in gastric carcinoma (SP 400 ×);Fig 2 Expression of P16 protein in bile reflux gastritis (SP 400 ×)

2.2 P16 在不同组织的表达 P16 的表达从正常胃黏膜83.3%(40/48)、胆汁反流性胃炎48.1(25/52)、癌旁组织40.8%(20/49)、胃癌组织7.8%(4/51)中阳性表达率逐渐降低(P ＜0.05)。不同组织的P16 表达，胃癌组显著低于癌旁组、胆汁反流性胃炎组和正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P ＜0.05)。胆汁反流性胃炎组低于正常胃黏膜组(P ＜0.05)，但癌旁组与胆汁反流性胃炎组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 肠上皮化生和不典型增生检出率 肠上皮化生检出率:胆汁反流性胃炎34.6%(18/52)显著高于正常胃黏膜6. 3% (3/48)，差异有统计学意义(P ＜0.05);不典型增生检出率:胆汁反流性胃炎42. 3%(22/52)高于正常胃黏膜10.4%(5/48)，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

胆汁反流性胃炎是由于幽门功能不全、胃窦十二指肠协调运动障碍、胃排空延迟或胆囊功能障碍等因素导致过量含胆汁的十二指肠液反流入胃，破坏胃黏膜表面的黏液屏障，损伤黏膜上皮，引起黏膜充血水肿等炎症改变，临床表现缺乏特异性，主要依靠胃镜诊断，在病理学上存在一定比例的肠上皮化生和不典型增生。国内外有研究，长期胆汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鳞状上皮增生，并可能与肠化生甚至癌变有关。Barrett’s 食管中胆汁反流可能有重要的致癌作用［4］。国外有学者报道胆汁反流性胃炎与胃黏膜肠上皮化生有关联，存在胃黏膜肠上皮化生的患者胃内总胆酸的浓度明显高于无肠上皮化生者［5］。王学伟等［6］对大鼠胆汁反流模型研究发现，长期胆汁反流可导致大鼠胃黏膜腺上皮和鳞状上皮显著增生，并发生异型增生和癌变。

本组研究中胆汁反流性胃炎肠上皮化生和不典型增生检出率分别为34.6%和42.3%，显著高于正常胃黏膜组(6.3%和10.4%)，提示胆汁反流性胃炎可能与胃癌的发生相关。

P16 蛋白为细胞周期负调控蛋白。由Kamb 和Nobori 等［7-8］于1994 年报道，P16 蛋白通过与细胞周期蛋白(cyclin)竞争性结合周期蛋白依赖性激酶cyclin-dependent kinase(CDK)，从而抑制cyclinD1-CDK4或CDK6 的活性，降低抑癌基因Rb 磷酸化，阻止细胞由G1期进入S 期进而抑制细胞增殖，呈现抑癌基因作用。P16 基因表达抑制胃癌细胞增殖并诱导胃癌细胞G1期阻滞［9］。在细胞周期调控中，P16 的失活及其缺失或突变在肿瘤发生过程中起重要作用。有研究表明，P16 蛋白产物缺失或丧失活性发生在胃黏膜上皮癌变的早期阶段，是重要的胃癌促发因素，该基因可能作为一个潜在的胃癌早期诊断分子标志，是癌变早期的分子事件之一［10］。

本研究显示，P16 的表达从正常胃黏膜、胆汁反流性胃炎、癌旁组织、胃癌组织中阳性表达率逐渐降低，且在胃癌组中的表达显著低于其他组，提示P16 在胃癌组织中有较高频率的缺失及表达水平下降。表明P16 基因缺失或突变而不能正常表达时引起肿瘤细胞异常增殖，P16 基因是重要的胃癌促发因素。且P16的表达在胆汁反流性胃炎组的表达显著高于正常胃黏膜组，但癌旁组和胆汁反流性胃炎组比较，差异无统计学意义。提示胆汁反流性胃炎有癌变倾向，可能属于癌前病变。

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