双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用

双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用*

**通信作者 E-mail:shaojunliu@yahoo.com

网络出版时间：2015-09-11网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2321.062.html

黄桢钧， 刘彬， 刘本荣， 刘少军**

(广州心血管疾病研究所 广州医科大学附属第二医院 心内科， 广东 广州510260)

[摘要]目的： 探讨双荧光mRFP-eGFP-LC3(ptfLC3)体系在细胞自噬中的作用。方法: 采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293)，蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-I比值；单荧光GFP-LC3质粒和双荧光mRFP-eGFP-LC3质粒转染HEK293细胞，雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h，采用荧光显微镜统计，并比较两种方法转染后HEK293细胞内LC3亮点的变化。结果： 不同浓度雷帕霉素处理HEK293细胞，LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值均增加；转染GFP-LC3质粒时，雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色亮点的数量增加；转染mRFP-eGFP-LC3质粒时，雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色和红色亮点数量均增加。结论： 双荧光mRFP-eGFP-LC3体系优于单荧光GFP-LC3体系，更能全面完整地反映细胞自噬水平，能够反映细胞内自噬流的变化，是自噬定量分析的可靠方法。

[关键词]雷帕霉素； 自噬； 人胚肾细胞； LC3； 单荧光GFP-LC3质粒； 双荧光mRFP-eGFP-LC3

[基金项目]*国家自然科学基金青年项目(81300151)

[中图分类号]R34-33

Evaluating the Effect of Dual-Fluorescence mRFP-eGFP-LC3 in Autophagy

HUANG Zhenjun, LIU Bin, LIU Benrong, LIU Shaojun

(DepartmentofCardiology,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,theSecondAffiliatedHospital

ofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,Guangdong,China)

Abstract[] Objective:To investigate the effect of dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 (ptfLC3) in autophagy. Methods: HEK293 cells were treated with rapamycin(50, 100, 200, 500, 1 000 nmol/L)for 3h and then adopting Western blot to test the expression of LC3 protein and ratio of LC3-II/LC3-I. Mono-fluorescence GFP-LC3 and dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 transfected HEK293 cells. 24 h after the transfection, the cells were treated with rapamycin(200 nmol/L)for an additional 3 h, then analyzed by fluorescence microscopy to compare the spot change of LC3 in HEK293 cells. Results: Different concentration of rapamycin increased the ratio of LC3-II/LC3-I in HEK293 cells. After transfected with plasmids, green spot increased in rapamycin treated HEK293 cells; while for mRFP-eGFP-LC3 plasmids transfection, green and red spot increased in rapamycin treated HEK293 cells. Conclusion: Dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 is superior to mono-fluorescence GFP-LC3, which can comprehensively reflect the level of autophagy and changes of autophagic flux, providing a reliable method for the quantitative analysis of autophagy.

[Key words] rapamycin; autophagy; human embryonic kidney cells; LC3; mono-fluorescence GFP-LC3 plasmid; dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3

自噬(autophagy)即自体吞噬，与异体吞噬相对，是细胞内形成的双层膜结构包绕自己内部受损伤的蛋白质或细胞器，比如线粒体、内质网或高尔基体碎片等，进而与溶酶体融合将其内容物降解的过程。越来越多的研究发现，自噬与恶性肿瘤、心脏疾病、神经退行性疾病等密切相关[1-2]，这使得自噬成为一个非常热门的研究领域，也建立了一系列与之相适应的自噬检测方式，如电镜和荧光显微镜的应用，蛋白印迹法检测自噬相关蛋白LC3和P62，长寿命蛋白的检测等等。然而，自噬的复杂性和许多未知性决定了联合应用多种检测方式的必要性，因为到目前为止还没有任何一种方法能够全面反映自噬水平的变化，尤其是定量分析方法还不成熟，存在许多缺点。本研究介绍一种可靠的自噬定量分析方法，即双荧光mRFP-eGFP-LC3体系，并将其与GFP-LC3和蛋白印迹法相比较，以期解决在应用该方法时面临的一些实际问题，为自噬活性的检测、尤其是在自噬定量分析方面提供参考。

1材料和方法

1.1试剂与仪器

DMEM培养液购自Gbico公司，雷帕霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，GFP-LC3质粒由本实验室构建。mRFP-eGFP-LC3质粒购自Addgene(plasmid：21074)[3]，Lipofactamine 3000转染试剂盒购自Life Technologies，LC3B兔抗人多克隆抗体购自Sigma公司(#L7543)，β-Tubulin鼠抗人单克隆抗体(#M20005)购自Abmart公司，HRP标记羊抗兔、羊抗小鼠IgG购自Cell Signaling公司(#7074，#7076)。仪器和耗材包括Thermo scientific 3110系列II CO2培养箱、AMG EVOS fl荧光显微镜、Sonics & Materials超声波破碎仪、Thermo scientific BCA蛋白测定试剂盒、Biotek Epoch酶标仪以及BIO-RAD电泳仪和转膜仪。

1.2HEK293细胞培养

HEK293细胞购自中国科学院细胞库，采用DMEM高糖培养液(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素)培养，在37 ℃、5% CO2、湿化的培养箱中培养，2 d换液1次，隔4～5 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3蛋白印迹法检测LC3-II/LC3-I表达

采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理HEK293细胞3 h后收获细胞，4 ℃预冷PBS洗2遍，用适量RIPA裂解液冰上裂解5 min，刮下细胞，30%强度超声1 s×3次。4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。BCA法测定蛋白浓度，12% SDS-PAGE200V电泳，100 V转膜1 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗LC3(1∶2 000)和β-Tubulin(1∶5 000)4 ℃孵育过夜。用相应种属二抗室温孵育1 h。ECL发光显影。Image-Pro Plus6.0软件分析Western blot条带的灰度值，并计算LC3-II/LC3-I的比值。

1.4单荧光GFP-LC3质粒转染

采用GFP-LC3质粒瞬时转染HEK293细胞，24 h后再用雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h，400倍荧光显微镜下观察细胞内GFP-LC3绿色亮点的变化，并在每个实验组随机选取300个细胞进行拍照，重复3次，取平均值。

1.5双荧光mRFP-eGFP-LC3质粒转染

mRFP-eGFP-LC3质粒转染HEK293细胞24 h，再以雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h，400倍荧光显微镜观察细胞内红色和绿色LC3亮点变化，随机选取300个细胞拍照，包括红色荧光图、绿色荧光图，重复3次，取平均值。

1.6统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行分析，两组数据之间的比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学差异。

2结果

2.1LC3蛋白及LC3-II/LC3-I比值

雷帕霉素处理HEK293细胞后，LC3-II蛋白及LC3-II/LC3-I比值均增加,并呈浓度依赖性，见图1。

图1　不同浓度雷帕霉素处理后HEK293 细胞LC3蛋白的表达 Fig.1　The expression of LC3-II/LC3-I in HEK293 cells after treated with different concentration of rapamycin

2.2mRFP-eGFP-LC3质粒图谱及其蛋白的表达

ptfLC3质粒可表达出mRFP-eGFP-LC3融合蛋白(图2)，该蛋白中mRFP发射红色荧光，eGFP发射绿色荧光。

2.3双荧光mRFP-eGFP-LC3体系与单荧光GFP-LC3体系

单荧光法可见GFP-LC3亮点增加，表明细胞内自噬体增加；双荧光法可见红色和绿色亮点均增加，在红、绿色合成图像中黄色亮点(自噬体)和红色亮点(自噬溶酶体)均增加(图3)。

图2　mRFP-eGFP-LC3质粒图谱及蛋白表达 Fig.2　Plasmid map of mRFP-eGFP-LC3 and the protein expression

3讨论

目前，研究自噬的定量分析方法多使用GFP-LC3法，即通过转染可表达GFP-LC3融合蛋白的质粒，使LC3携带有绿色荧光，从而可通过荧光显微镜观察细胞内LC3的定位和转化。LC3-I在细胞质内散在分布，荧光显微镜下呈弥散分布的绿色荧光，而LC3-II则聚集在自噬囊泡的内外膜上，包括自噬前体、自噬体、自噬溶酶体，使得这些自噬结构呈绿色亮点(LC3亮点)。因此我们可以用LC3亮点来反映细胞内自噬囊泡的数量。但由于绿色荧光在自噬体与溶酶体融合成自噬溶酶体后的酸性环境下易淬灭，GFP-LC3法用于自噬定量分析的准确性欠佳。

注：A、B为LC3荧光亮点的典型图像，C为平均每个细胞含有的自噬体(GFP-LC3亮点)，D为平均每个细胞含有的 自噬体(合成图像中的黄色亮点)和自噬溶酶体(合成图像中的红色亮点)； (1)与对照组比较，P<0.05 图3　双荧光mRFP-eGFP-LC3体系与单荧光GFP-LC3体系比较 Fig.3　Comparison of dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 and mono-fluorescence GFP-LC3 in HEK293 cell

双荧光mRFP-eGFP-LC3体系是比GFP-LC3更可靠的自噬定量分析方法。该体系最大的优点是可以同时直观地判断细胞自噬活性和自噬流(自噬通量)的变化，而不需要外加其它药物干预。根据RFP红色荧光不易在溶酶体酸性环境下降解的特点[3-4]，本研究采用mRFP-eGFP-LC3转染细胞。由于LC3携带有mRFP的红色荧光和eGFP的绿色荧光，并可大量聚集在自噬前体和自噬体膜上, 使它们在荧光显微镜的红绿合成图像中呈黄色亮点；但LC3携带的eGFP绿色荧光在自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体的酸性条件下发生淬灭，而mRFP红色荧光耐受降解，使自噬溶酶体呈红色亮点。因此mRFP红色荧光可全程标记和追踪LC3,而eGFP的减弱可以指示自噬体和溶酶体的融合。当自噬被诱导时，黄色亮点(主要是自噬体)和红色亮点(自噬溶酶体)都增加；当自噬被抑制引起自噬体生成减少时，黄色亮点和红色亮点都减少；当自噬被抑制引起自噬体降解障碍时，黄色亮点增加，红色亮点减少或者不变。据此我们还可以根据黄色和红色的相互对比监测自噬体到自噬溶酶体的转化，因为自噬过程是否顺畅影响细胞的生理状态。本研究以雷帕霉素处理HEK293细胞,蛋白印迹法检测LC3-II及LC3-II/LC3-I均增加，这说明雷帕霉素可诱导HEK293细胞自噬，建立雷帕霉素诱导的HEK293细胞自噬模型；并以该细胞模型为基础双荧光mRFP-eGFP-LC3体系与单荧光GFP-LC3体系进行比较，结果显示mRFP-eGFP-LC3体系具有更大的优越性，它可以同时反映自噬体和自噬溶酶体的变化，监测细胞内自噬流的变化，因而可以取代GFP-LC3用于自噬定量分析。

在应用双荧光法时需要注意几个问题。(1)许多细胞尤其是肿瘤细胞保持着一定水平的基础自噬，转染mRFP-eGFP-LC3后即可观察到一定数量的LC3亮点，需要设立严格的实验对照。(2)串联mRFP-eGFP-LC3的表达和转染试剂本身可能对细胞有一定的毒性，使本底LC3亮点增加，mRFP-eGFP-LC3蛋白表达过多也会使背景太亮难以准确计数亮点，因此必须优化转染条件。本研究使用毒性更小的Lipo3000，根据细胞状况确定质粒DNA与转染试剂的最佳比例，并在转染后等待24～48 h再处理细胞，大大减少了背景水平，方便计数。(3)最好使用超过一个时间点观察早期自噬体的增加和随后晚期自噬体的增加，作为自噬流维持的一个额外保证[5]。(4)确立一套合理的计数标准非常重要，否则很容易引起误差导致统计结果不准确，因为目前还没有统一的标准来明确多大、多亮的斑点才纳入统计。在某些情况下自噬体会发生相互融合，形成更大的亮点，而亮点的大小与自噬水平的还不明确；而当LC3亮点大量增加时也会使计算十分困难。(5)本研究分别统计了平均每个细胞含有的黄色和红色LC3亮点数目，是比较可靠合理的方法[6]，也可以统计含有LC3亮点的细胞占所有细胞的百分比。(6)目前已经有人尝试使用特殊的图像识别系统应用于自噬结构的定量分析[7-8]。

另外在应用双荧光结构体系时使用Cellomics显微镜对黄色亮点和红色亮点进行自动化定量分析，可以在许多随机的视野内评估大量的细胞(1 000个以上),这会比手动评估一些挑出来的细胞更准确、更可靠[9]。

总之，根据双荧光结构能够发出不同荧光信号及其对酸性PH的敏感性不同，为监测许多细胞类型的自噬流提供了一个方便的方法。目前，双荧光mRFP-eGFP-LC3已经逐渐得到许多学者的认可，相信会在自噬的研究领域得到越来越广泛的应用。

4参考文献

[1] Lucin KM,Wyss-coray T. Targeting autophagy for disease therapy[J]. Nature Biotechnology, 2013(4)：322-323.

[2] Nixon RA. The role of autophagy in neurodegenerative disease[J]. Nature Medicine, 2013(8)：983-997.

[3] Kimura S,Noda T,Yoshimori T. Dissection of the Autophagosome Maturation Process by a Novel Reporter Protein,Tandem Fluorescent-Tagged LC3[J]. Autophagy, 2007(3):5,452-460.

[4] Shanware NP,Bray K,Eng CH,et al. Glutamine deprivation stimulates mTOR-JNK-dependent chemokine secretion[J]. Nature Communications, 2014(5)：4900.

[5] Cherra SJ,Kulich SM,Uechi G,et al. Regulation of the autophagy protein LC3 by phosphorylation[J]. J Cell Biol， 2010(190):533-539.

[6] Hariharan N,Maejima Y,Nakae J,et al. Deacetylation of FoxO by Sirt1 Plays an Essential Role in Mediating Starvation-Induced Autophagy in Cardiac Myocytes[J]. Circ Res, 2010(107):1470-1482.

[7] Nyfeler B,Bergman P,Triantafellow E,et al. Relieving autophagy and 4EBP1 from rapamycin resistance[J]. Mol Cell Biol, 2011(31):2867-2876.

[8] Nyfeler B. Molecular biology;study results from novartis animal health update understanding of molecular biology[J]. Life Science Weekly, 2012:5220.

[9] Sarkar S,Korolchuk VI,Renna M,et al. Complex inhibitory effects of nitric oxide on autophagy[J]. Mol Cell, 2011(43):19-32.

(2015-05-22收稿，2015-08-16修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 赵毅