一株产高温纤维素酶菌株的分离筛选

蒋 芳，刘松青*，甄阳光，谢光美

一株产高温纤维素酶菌株的分离筛选

蒋 芳1，刘松青2*，甄阳光1，谢光美1

（1. 四川省水产学校，成都 郫县 611730；2. 成都师范学院 化学与生命科学学院，成都 温江 611130）

从牛粪堆肥中，筛选出一株产高温纤维素酶的菌株。通过形态学观察，初步判定为木霉属菌株，命名为木霉SW-04。该菌株经初始摇瓶发酵后测定粗酶液CMC酶活力2.179 IU/mL，最适反应温度为70℃，在50、60、70、80、90℃分别保温60 min后，仍可分别保持62.7%、61.8%、72.2%、68.1%、54.8%的酶活力，证明该酶具有较好的热稳定性。

纤维素酶；耐高温；筛选；酶学性质

纤维素是地球上分布最广、最丰富的可再生资源，目前大部分用于燃烧或者废弃，如果能有效地利用微生物转化技术将纤维素转化为简单的糖类，再转化成燃料、食物和化学制品等，不仅可以变废为宝，而且对缓解全球能源危机、环境污染、资源紧张等方面都有重要的意义[1]。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶系的总称，纤维素酶作为纤维素降解与转化的关键，得到了人们的普遍关注[2]。随着经济的发展，纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、工业生产等方面挖掘出更大的潜力。

纤维素酶的生产主要来自于自然界中的微生物，我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，目前已在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、酶学性质研究、基因的克隆与表达，以及纤维素酶在纺织、饲料、能源等方面的应用都取得较大进展[3-4]。由于纤维素酶产生菌和其产生的纤维素酶在具体的使用过程中需耐受一定的高温条件，耐高温纤维素酶的耐热性在生产中具有非常大的实用价值，可较好地解决酶在高温下变性的问题，高温下可加快降解速度，减少杂菌的污染。因此，耐高温纤维素酶产生菌株的选育显得尤为重要[5]。

本研究应用常规的筛选方法获得了一株产高温纤维素酶的菌株SW-04，是一株很有应用价值的纤维素酶工业化生产出发菌株。对该菌株的酶学性质进行了初步研究，为耐高温纤维素酶工业化生产和应用提供了一定的参考依据。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

从牛粪堆肥中分离筛选得来，菌株命名为SW-04。

1.1.2 培养基

富集培养基：醋酸浸泡处理定量分析滤纸（10张），MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO41 g，NaCl 0.1 g，NaNO32.5 g，用蒸馏水溶解并定容到1 000 mL。

刚果红筛选培养基：CMC-Na 2g，刚果红0.4 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g,，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5 g，琼脂20 g，用蒸馏水溶解并定容到1 000 mL。

种子培养基：CMC-Na 10g，蛋白胨3 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g,，CaCO31 g，用蒸馏水溶解并定容到1 000 mL。

发酵培养基：玉米粉5 g， 酵母提取物3 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO44 g，CaCl2·2H2O 2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，用蒸馏水溶解并定容到1 000 mL。

1.1.3 试剂与溶液

0.1 M乙酸―乙酸钠缓冲溶液，0.6% DNS试剂，1% CMC-Na溶液，1 mg/mL葡萄糖标准溶液。

1.2 方法

1.2.1 纤维素酶产生菌株的分离

1）菌种的初筛

吸取0.1 mL经富集培养的牛粪稀释液涂布于CMC-Na刚果红平板，倒置于37℃恒温培养3 d，挑选透明圈大的菌落进行划线分离至纯种，斜面保藏。

2）菌种的复筛

将初筛得到的水解圈较大的菌株按照DNS还原糖法进行酶活测定，筛选出本实验的出发菌株。

1.2.2 菌种的形态特征鉴定

于刚果红平板培养基上培养3d后，观察其菌落形态；用解剖针挑取少量菌体，置载玻片的水滴中，加盖玻片于显微镜下观察其形态特征。

1.2.3 CMC酶活力的测定

将菌株SW-04接种于种子培养基培养24 h后，接种于液体发酵培养基中，30℃ 120 r/min摇瓶培养72 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液，根据DNS还原糖法在50℃下测定其CMC酶活力。

1个酶活力单位定义为1 mL酶液1 min内水解底物生成1 μmol葡萄糖所需酶量[3]。

1）葡萄糖标准曲线的制备

分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，1 mg/mL的葡萄糖标准溶液于25 mL刻度试管中，加蒸馏水至1 mL，加DNS试剂3 mL，沸水中煮沸10 min，冷却定容至25 mL，在550 nm处测OD值[5]。

2）CMC酶最适反应温度的测定

粗酶液分别在40、50、60、70、80℃下测定其酶活，确定酶的最适反应温度。

3）CMC酶的热稳定性实验

将粗酶液分别置于50、60、70、80、90℃ 的水浴中保温1 h后测定其酶活，计算各温度下残余酶活百分比。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离筛选结果

2.1.1 纤维素酶产生菌的初筛

将牛粪稀释液涂布于刚果红筛选平板上培养3 d后，筛选到水解圈较大的菌株5株。菌株SW-04在刚果红平板水解圈结果如图1所示。

图1 菌株SW-04在刚果红平板上形成的水解圈

图2 葡萄糖标准曲线

2.1.2 葡萄糖标准曲线的制备结果

将葡萄糖标准曲线的测定结果应用生物统计学的方法，计算出该标准曲线的一元线性回归方程为y＝0.474 1 x－0.011 6，并用相关系数检验回归方程，其相关系数为R2＝0.995 7，其线性相当好，可以用于酶活力的测定。葡萄糖标准曲线测定结果如表1所示，葡萄糖标准曲线的绘制如图2所示。

表1 葡萄糖标准曲线测定结果

2.1.3 纤维素酶产生菌的复筛

将筛选得到的5株菌株纯化后进行液体发酵，取发酵液离心后在50℃下进行CMC酶活力测定，最终得到一株产酶稳定具有较高酶活的纤维素酶产生菌株SW-04。结果如表2所示。

表2 初筛菌株的CMC酶活力测定结果

2.2 菌株的形态特征鉴定结果

菌株SW-04菌落生长迅速，平板上培养3d后，菌落呈白色，蛛网状，继续培养，菌落转变为绿色。显微镜下镜检观察孢子成厚壁孢子，圆形或者椭球形，孢子形态如图2所示，菌丝形态如图3所示，初步将该菌株归为木霉属菌株。

2.3 CMC酶酶学性质的初步研究

2.3.1 CMC酶最适反应温度的测定结果

粗酶液分别在40、50、60、70、80℃下测定其酶活力，测定结果发现，菌株SW-04最适反应温度为70℃。实验结果如表3所示。

表3 菌株SW-04 CMC酶最适反应温度的测定结果

图3 菌株SW-04孢子形态特征

图4 菌株SW-04菌丝形态特征

2.3.2 CMC酶热稳定性测定结果

粗酶液分别在50、60、70、80、90℃下保温1 h后测定其酶活力，测定结果发现，菌株SW-04，分别在不同温度下保温60 min后与酶的最适发酵温度下酶活力进行比较，分析其剩余酶活比例，发现其在70℃保温60 min后仍有72.2%的活力，在80℃保温60 min后仍有68.1%的酶活力，在90℃保温60 min后仍有54.8%的酶活力。说明菌株SW-04产生的纤维素酶热稳定性比较好，具有较好的开发价值。实验结果如表4所示。

表4 菌株SW-04 CMC酶热稳定性的测定结果

3 结论

目前，研究得较多的纤维素酶生产微生物有木霉、曲酶和青霉等，其中木霉来源的纤维素酶的产业化最为广泛，但大多数商业化的纤维素酶是中温真菌的胞外酶，这些酶虽然水解活力高，但在应用方面的一个主要缺陷是在高温环境下易失活[6]。由于大多数工业过程都在高温下（＞60℃）进行，因此对嗜热/耐热纤维素酶的需求就越来越迫切，同时耐高温纤维素降解菌来源的纤维素酶因具有活性高、热稳定性好、使用过程中不易被污染等优势而受到广泛关注。近年来，在研究耐热纤维素酶的过程中，嗜热真菌引起了广大学者的关注[7]。嗜热真菌所产纤维素酶通常在pH 4.0～7.0有活性，最适作用温度大多在60～75℃，且在长时间的保温过程中具有较好的热稳定性[8]。实际上，除了嗜热真菌，中温真菌也可产生嗜热纤维素酶。在丝状真菌Fusarium axysporum中发现了新型的嗜热内切葡聚糖酶，其最适作用温度为75℃，但在70℃下的酶活半衰期仅为15 min[9]。本文筛选得到一株产高温纤维素酶的菌株SW-04，其CMC酶最适反应温度为70℃，具有很好的热稳定性。粗酶液在50、60、70、80、90℃下保温1 h，仍分别剩余62.7%、61.8%、72.2%、68.1%、54.8%的CMC酶活。因此在后续的工作中，将在生产工艺优化、代谢调控技术、工业产业化应用等方面对菌株SW-04展开深入的研究。有望为高温纤维素酶的工业化生产及应用提供优良菌株。

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Isolation and Screening of a Thermophilic Cellulose Bacterial Strain

JIANG Fang1, LIU Song-qing2*, ZHEN Yang-guang1, XIE Guang-mei1
（1.Sichuan School of Fisheries, Chengdu 611730, China; 2. College of Chemistry and Life Science, Chengdu Normal University, Chengdu 611130, China）

A bacterial strain with high temperature tolerance cellulase was isolated from the cow dung compost. The strain was preliminarily identified and named as Trichoderma SW-04 by its morphological observation. The CMCase was 2.179 IU/mL. The enzyme had the highest activity when temperature was 70℃. Respectively incubation for 60 minutes at 50、60、70、80、90℃, the enzyme still retained 62.7%、61.8%、72.2%、68.1%、54.8% of its maximum activity. The enzyme also showed good thermal stability.

cellulose; high-temperature resistance; isolation; enzymic property

Q815

A

1004-8405(2015)02-0050-05

2015-02-12

蒋 芳 （1981～），女，讲师，硕士；研究方向：微生物资源及应用。

* 通讯作者：刘松青（1969～），男，副教授，博士；研究方向：微生物资源与生物技术。biosq@126.com