灵芝孢子粉对脂多糖诱导的人气道上皮细胞损伤的保护作用

灵芝孢子粉对脂多糖诱导的人气道上皮细胞损伤的保护作用

姚金福赵婉军杨波樊湘泽范晓清

(长春中医药大学药学院,吉林长春130117)

摘要〔〕目的探讨灵芝孢子粉对脂多糖(LPS)诱导细胞损伤的保护作用及机制。方法对16HBE细胞体外培养，分别给予不同剂量灵芝孢子粉预保护24 h后，给予LPS(1 μg/ml)刺激6 h，采用MTT法检测气道上皮细胞活性，检测细胞上清液中的超氧化歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)等。采用Western印迹检测细胞内核因子(NF)-κB蛋白表达。结果灵芝孢子粉可明显提高人气道上皮细胞的活力，显著降低细胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6；显著提高SOD的含量；并显著降低细胞内NF-κB蛋白表达。结论灵芝孢子粉对LPS诱导的人气道上皮细胞损伤有保护作用。

关键词〔〕灵芝孢子粉；人气道上皮细胞；脂多糖

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：吉林省中医药管理局资助项目(2012-074)

第一作者：姚金福(1960-)，男，副教授，主要从事中医学、中药学研究。

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，气道上皮细胞可以合成和释放多种炎症介质和细胞因子，这些因子是哮喘发病的主要原因，气道炎症可以引起上皮细胞分泌炎症介质，并造成炎症反应的加重，从而造成上皮细胞的凋亡脱落；同时，还会造成气道内细胞及组织的改变和气道重塑〔1～4〕。灵芝孢子粉为担子菌纲多孔科灵芝属真菌灵芝生长成熟后散发出来的孢子体，富含多糖、肽、有机锗、多种氨基酸、脂肪酸及微量元素等成分。孢子粉可改善机体的免疫功能， 减轻放、化疗的不良反应。药理研究表明，灵芝孢子粉可明显增强人体免疫功能，并对多种肿瘤有明显的抑制作用〔5～7〕。本研究通过研究灵芝孢子粉对脂多糖(LPS) 致人气道上皮细胞损伤的影响，评价灵芝孢子粉保护人气道上皮细胞的作用机制。

1材料与方法

1.1试验药物灵芝孢子粉由吉林省长白工坊科贸有限公司提供，经长春中医药大学王德友教授鉴定为正品。

1.2试剂人气道上皮细胞株16HBE(吉林大学基础医学院)；丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，白介素(IL)-6、 肿瘤坏死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κBP65抗体等试剂盒购自上海研域生物科技有限公司；改良细胞培养基(DMEM)(高糖)和胎牛血清(上海科敏生物科技有限公司)；LPS(L2880，大肠杆菌055)、B5HNE和四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma公司)。

1.3仪器超净工作台：苏州安泰BSC-1600型生物洁净安全柜。细胞计数仪：美国Invitrogen公司。CO2培养箱：美国Nuaire公司。电泳仪：美国伯乐公司。酶标仪：美国伯乐公司。

1.4方法

1.4.1人气道上皮细胞培养及分组16HBE细胞用含10%胎牛血清DMEM(高糖)完全培养基培养，以1×105/ml接种于24孔板中并置于37℃，饱和湿度CO2培养箱中培养。细胞融合达70%时更换成无血清DMEM(高糖)培养基继续培养24 h后分组：①空白对照组，无血清DMEM(高糖)培养基培养；②LPS组(LPS 1 μg/ml)；③低灵芝孢子粉组(灵芝孢子粉0.5 g/L)；④中灵芝孢子粉组(灵芝孢子粉1 g/L;⑤高灵芝孢子粉组(灵芝孢子粉2 g/L)。除空白对照组，其余各组使LPS作用6 h后，检测各项指标。

1.4.2MTT检测培养细胞加入各浓度灵芝孢子粉培养24 h后，加入1 μg/ml的LPS，继续培养24 h后每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，492 nm波长测定吸光度。计算细胞的存活率。

1.4.3检测SOD，MDA，TNF-α，IL-6收集各种细胞上清液，按照检测试剂说明书进行检测。

1.4.4检测细胞内NF-κBP65收集各组细胞并加入预冷的RIPA裂解液和相应的蛋白酶抑制剂，4℃，15 000 r/min离心15 min后取上清液，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg上清液经8% SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶37℃封闭1 h后，一抗4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育1 h。显色后，以相应的总蛋白表达水平作为内参照。

1.5统计学处理应用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1灵芝孢子粉对人气道上皮细胞活力的影响与空白对照组〔(92.11±3.01)%〕相比，LPS组显著降低16HBE细胞活力〔(52.07±2.15)%〕；而低、中、高浓度各组灵芝孢子粉均能显著提高细胞活力〔(69.82±2.11)%、(75.12±2.39)%、(79.28±2.52)%〕。见表1。

2.2灵芝孢子粉对人气道上皮细胞上清液MDA与SOD的影响与空白组相比,LPS组细胞上清液中MDA含量升高，SOD含量降低;各组灵芝孢子粉可降低上清液中MDA含量，升高SOD含量。见表1。

2.3灵芝孢子粉对人气道上皮细胞上清液TNF-α，IL-6的影响与空白组相比,LPS组细胞上清液中TNF-α，IL-6含量升高;各组灵芝孢子粉可降低上清液中MDA含量，提高SOD含量。见表2。

2.4灵芝孢子粉对人气道上皮细胞NF-κBP65的影响与空白组(0.11±0.061)相比,LPS组细胞内NF-κBP65含量升高(0.72±0.103);低、中、高剂量组灵芝孢子粉可降低NF-κBP65含量(0.58±0.089、0.39±0.072、0.31±0.121)。见图1。

表1　灵芝孢子粉对SOD、MDA的影响

与LPS组比较：1)P<0.05，下表同

表2　灵芝孢子粉对TNF-α，IL-6的影响

A：空白组；B：LPS组；C：灵芝孢子粉0.5 g/L；D：灵芝孢子粉1 g/L；E：灵芝孢子粉2 g/L 图1　各组16HBE细胞中NF-κBP65蛋白水平

3讨论

近年来，对哮喘的研究多集中在炎性细胞的浸润和平滑肌细胞的增殖方面，而对气道上皮的研究不多。而气道上皮损伤与气道炎症的发生相关，也是导致气道重塑、哮喘难于治疗的重要因素〔8〕。TNF-α、IL-6等多种炎症介质的启动子和增强子中都存在着NF-κB序列，NF-κBP65的活化促进炎症因子的生成〔9,10〕。本实验结果显示灵芝孢子粉可减低LPS损伤细胞上清液中的MDA、TNF-α、IL-6，提高SOD，并能减低细胞内NF-κBP65含量。因此，认为灵芝孢子粉有保护气道上皮细胞损伤作用。

4参考文献

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7Payne DN,Rogers AV,Adlehoth E,etal.Early thickening of the reticular basement membrane in children with difficult asthma1 〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2003;167(1):78-82.

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〔2014-07-15修回〕

(编辑徐杰)

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