锌指蛋白3在非小细胞肺癌中的表达

锌指蛋白3在非小细胞肺癌中的表达

银瑞董新伟王铮

(南阳市中心医院胸外科，河南南阳473009)

摘要〔〕目的探讨锌指蛋白(ZBED)3在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与临床病理资料的相关性。方法50对原发性肺癌及癌旁组织行免疫组化、荧光定量PCR检测ZBED 3蛋白、mRNA的表达；12对新鲜肺癌及癌旁组织行Western印迹检测ZBED 3蛋白的表达；统计学软件分析不同临床病理指标与ZBED 3表达的相关性。结果免疫组化实验显示ZBED 3表达定位于细胞质及少数细胞核，癌细胞中ZBED 3表达的阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)；Western印迹试验证实ZBED 3在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)；实时荧光定量PCR检测肺癌组织mRNA表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)；ZBED 3在NSCLC中的表达与患者年龄、性别、肿瘤分化及组织学类型等无显著相关性(P>0.05)，但与淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)。结论ZBED 3在NSCLC中过度表达，并与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期相关。

关键词〔〕锌指蛋白3；肺癌；Wnt通路

中图分类号〔〕R734.2〔文献标识码〕A〔

第一作者：银瑞(1973-)，男，硕士，副主任医师，主要从事胸外科疾病的临床诊治和基础研究。

Wnt通路在细胞的增殖、凋亡、癌变等过程中起重要作用，β-catenin在通路的调控中处于中心地位，且受Axin复合体调控。Axin是一个肿瘤抑制因子，在细胞增殖及癌变过程中起关键作用，但Axin的功能需通过其配体作用得以调节〔1〕。研究显示，锌指蛋白(ZBED)3是一种新的Axin结合蛋白〔2〕，据此推测ZBED3可通过Wnt信号通路参与机体的重要生理病理过程。本课题研究ZBED3在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其临床意义。

1材料与方法

1.1材料50对原发性肺癌及癌旁组织来于南阳市中心医院胸外科2012年6月至2014年6月手术切除标本。患者术前均未接受放、化疗，年龄35～78岁，男35例，女15例。肺癌组织学分型及分级依据WHO2004版分类标准，其中鳞癌21例，腺癌29例；高分化12例，中分化20例，低分化18例；肿瘤临床分期依据国际抗癌联盟(UICC)2011年TNM分期标准：Ⅰ期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期1例。另取12对新鲜肺癌及癌旁组织快速冷冻于-70℃保存，用于Western印迹检测。

1.2免疫组化检测NSCLC及癌旁组织ZBED3的表达中性甲醛溶液固定肺癌及癌旁组织标本，石蜡包埋，连续切片，厚度为4μm，经脱蜡、脱苯、水化后，行抗ZBED3免疫组化染色，按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法试剂盒说明书步骤进行。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，结果判定：ZBED3染色部位为细胞质，观察染色强度(I)及范围(S)，Ⅰ分为强、中及弱三个级别，棕黄色颗粒且深染为强表达(3分)，淡黄色无颗粒染为弱表达(1分)，中度表达介于二者之间(黄染颗粒状、2分)；S≥10%为阳性，并分为0～4四个等级，其中<10%记为0分，代表阴性，10%≤S≤25%为1分，25%

1.3荧光实时定量PCR测定ZBED3mRNA的表达取等量肺癌及癌旁组织，采用Trizol法提取组织总RNA，逆转录合成cDNA，采用荧光染料通过实时定量PCR方法检测ZBED3mRNA的表达，引物序列：5′-ACTGGGCACGCCTGTTGG-3′和5′-CGGGGCTCTGCTTCTTTA-3′，β-actin为内参，引物序列：5′-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′和5′-GATGTCACGCACGATTTC-3′，用2-△△Ct计算其相对表达量。

1.4Western印迹检测NSCLC及癌旁组织ZBED3的表达取等量肺癌及癌旁组织，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂，4℃充分裂解30min，低温12 000r/min离心35min，取上清，利用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度；每泳道加约60μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳，经湿转于聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，依次加入稀释的抗ZBED3抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗并依次洗脱，加入化学发光试剂，化学发光成像系统进行成像检测，利用QuantityOne软件进行图像灰度值分析，以各目的与内参条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。

1.5统计学方法应用SPSS13.0软件进行χ2、t检验。

2结果

2.1在NSCLC及癌旁组织中ZBED3免疫组化及Western印迹结果免疫组化实验显示ZBED3表达定位于细胞质及少数细胞核，在癌细胞中ZBED3表达的阳性率为62%(31/50)，显著高于癌旁组织10%(5/50)(P<0.05)。Western印迹试验证实ZBED3在肺癌组织中的表达(60.8%±3.1%)显著高于癌旁组织(20.3%±1.6%)(P<0.05)。

2.2ZBED3与临床病理之间的相关性ZBED3在NSCLC中的表达与患者年龄、性别、肿瘤分化及组织学类型等无显著相关性(P>0.05)，但与淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)。见表1。

表1　 ZBED 3与临床病理参数之间的关系(n)

2.3在NSCLC及癌旁组织中ZBED3mRNA表达量NSCLCZBED3mRNA表达水平(1.021±0.001)明显高于癌旁组织(0.104±0.002)(P<0.05)。

3讨论

锌指蛋白家族对DNA、蛋白质及RNA的识别和结合有一定的作用，ZBED3是锌指结构域蛋白家族的一名成员〔2〕，含有锌指的DNA结构域，可介导蛋白和DNA的结合，其基因位于人类第5号染色体上。人类ZBED3 蛋白由234个氨基酸组成，蛋白质分子量约为25kD〔3〕，利用基因芯片技术已发现ZBED3在人体组织中广泛表达〔4〕。

Wnt信号通路是当今的研究热点，参与细胞的调控、增殖、凋亡等〔1〕。Wnt信号通路是由Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等组成的复杂信号传导途径，其异常激活与肿瘤侵袭转移非常密切，主要由Wnt分子、Axin、GSK3β、β-catenin等组成〔5〕。β-catenin是Wnt通路正向调节的重要效应分子，在细胞质内降解失常，可在细胞核内累积激活一系列靶基因转录而形成肿瘤〔1〕。Axin为Wnt/β-catenin途径的重要调节因子，可使细胞质中的β-catenin磷酸化及降解，从而负调节Wnt/β-catenin通路，Axin表达或功能丧失可能是恶性肿瘤增殖的重要因素之一〔2〕。Tamai等〔6〕在研究低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白(LRP)5、6的过程中，发现其能够与Axin相互作用并抑制其活性，从而激活Wnt/β-catenin信号；Chen等〔7〕研究发现与LRP5、6功能相近的锌指蛋白ZBED3与Axin结合后，抑制Axin介导的糖原合成酶激酶对β-钙黏着蛋白的磷酸化并激活Wnt信号，促进肿瘤形成。

目前关于ZBED3在肺癌中的表达研究较少，本研究发现，相对于正常肺组织，ZBED3在NSCLC中过表达，并与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期相关，这提示ZBED3可能为维持NSCLC恶性表型的重要分子，并可能成为临床治疗的潜在靶点。

4参考文献

1LoganCY，NusseR.TheWntsignalingpathwayindevelopmentanddisease〔J〕.AnnuRevCellDevBiol，2004；20(8)：781-810.

2PeastonAE，KnowlesBB，HutchisonKW.Genomeplasticityinthemouseoocyteandearlyembryo〔J〕.BiochemSocTrans，2007；35(3)：618-22.

3CuiT，ZhangP，GuoX，et al.TheexpressionandsignificanceofZincfingerproteinZBED3inmouseoocyte〔J〕.ActaUniversitatisMedicinalisNanjing(NaturalScience)，2011；31(9)：1-4.

4FanC，JiangGY，ZhangXP，et al.Zbed3contributestomalignantphenotypeoflungcancerviaregulatingβ-cateninandP120-catenin1〔J〕.MolCarcinog，2015;54(S1):E138-E147.

5PolakisP.Wntsignalingandcancer〔J〕.GenesDev，2000;14(15)：1837-51.

6TamaiK，SemenovM，KatoY，et al.LDL-receptor-relatedproteinsinWntsignaltransduction〔J〕.Nature，2000;407(6803)：530-5.

7ChenT，LiM，DingY，et al.Identificationofzinc-fingerBEDdomain-containing3 (Zbed3)asanovelAxin-interactingproteinthatactivatesWnt/β-cateninsignaling〔J〕.JBiolChem，2009;284(11)：6683-9.

〔2015-03-09修回〕

(编辑袁左鸣)