益气化瘀化痰养阴剂对肝纤维化模型大鼠肝脏上皮间质表型的影响

益气化瘀化痰养阴剂对肝纤维化模型大鼠肝脏上皮间质表型的影响

高世娇陈文龙何英曹文富赖国旗1

(重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆400016)

摘要〔〕目的探讨益气化瘀化痰养阴剂对肝纤维化大鼠肝脏上皮间质表型的影响。方法将30只SD大鼠随机分为益气化瘀化痰养阴剂组、肝纤维化模型组和正常对照组，益气化瘀化痰养阴剂组及肝纤维化模型组用CCl4和高脂低蛋白饮食建立肝纤维化大鼠模型，益气化瘀化痰养阴剂组每日用益气化瘀化痰养阴剂灌胃，肝纤维化模型组和正常对照组则用等体积生理盐水。12 w后，采用Masson染色及电镜观察大鼠肝脏纤维化程度。采用荧光定量PCR检测大鼠肝脏FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad mRNA的表达，采用Western印迹法检测大鼠肝脏成纤维细胞特异蛋白(FSP1)、转化生长因子(TGF)-β1、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)及E-钙黏附蛋白(cad)蛋白的表达。结果与模型组相比，益气化瘀化痰养阴剂组肝组织Masson染色及电镜下均可见纤维化程度明显改善；益气化瘀化痰养阴剂组FSP1、TGF-β1、α-SMA mRNA及蛋白的表达较模型组明显降低(P<0.05)，而E-cad mRNA及蛋白的表达较模型组明显升高(P<0.05)。结论益气化瘀化痰养阴剂对大鼠肝纤维化具有一定干预作用，该作用可能与其抑制肝组织上皮间质转化的发生有关。

关键词〔〕肝纤维化；益气化瘀化痰养阴剂；上皮间质转化

中图分类号〔〕R563〔

基金项目：国家自然科学基金预研项目(No.NSFYY-201108)

通讯作者：何英(1962-)，女，副教授，主要从事老年病学及风湿免疫病学研究。

1重庆医科大学实验动物中心

第一作者：高世娇(1988-)，女，硕士，主要从事老年病学及风湿免疫病学研究。

Effects of Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation on epithelial mesenchymal transition in rats of liver fibrosis

GAO Shi-Jiao,CHEN Wen-Long,HE Ying,etal.

Department of Integrative Chinese and Western Medicine,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation on the liver histopathology and expression of epithelial mesenchymal transition (EMT) in liver fibrosis rats induced by CCl4.MethodsThe models of liver fibrosis were established with the methods of carbon tetrachloride and high fat,low protein diet.The successfully established SD rats were randomly divided into normal,model and Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation groups.The pathological changes of the liver tissue were observed by both light and electron microscopy.The expressions of FSP1,E-cad,α-SMA,TGF-β1 mRNA and protein in the liver tissue were detected by qRT-PCR and Western blot.ResultsCompared with that of model group,the degree of fibrosis in Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation group was decreased effectively,the FSP1,α-SMA and TGF-β1 mRNA and protein expressions were significantly lower in liver tissue(P<0.01).The E-cad mRNA and protein expressions were increased obviously in liver tissue(P<0.01).ConclusionsThe Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation might restrain the development of liver fibrosis by regulating the mRNA and protein expressions of EMT.

【Key words】Liver fibrosis；Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation；EMT

肝纤维化是多种慢性肝病发生发展的共同病理阶段，经典观点认为肝纤维化是由于肝内结缔组织异常增生、细胞外基质(ECM)的过度沉积及降解失衡所致。但近年来越来越多的研究表明，ECM并非唯一参与肝纤维化的因素，肝上皮细胞可通过上皮间质转化(EMT)获得迁移及表达纤维细胞经典标志物的能力，密切参与肝纤维化的形成〔1～6〕。本课题组前期研究〔3〕提示，益气化瘀化痰养阴合剂抑制大鼠肝纤维化作用优于益气、化瘀、化痰、养阴剂各剂单用，但其具体机制尚不十分清楚。本实验拟在前期实验基础上，观察大鼠肝脏中EMT相关的基因成纤维细胞特异蛋白(FSP1)、转化生长因子(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及钙黏附蛋白(E-cad)的表达，进一步探讨益气化瘀化痰养阴剂对肝纤维化中EMT发生的影响。

1材料与方法

1.1材料SPF级雄性SD大鼠30只，体重180～220 g，饲养于重庆医科大学实验动物中心，许可证号：〔SYXK(渝)2007-0001〕。选用黄芪、白术、川芎、姜黄、半夏、海藻、白芍、鳖甲(购自重庆桐君阁药房)按1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例配伍〔3〕，常规水煎，并浓缩成益气化瘀化痰养阴口服制剂(简称益气化瘀化痰养阴剂)，每1 ml含生药2 g。CCl4(分析纯，Sigma，美国)；Trizol(碧云天公司，中国)；逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司，中国)；兔抗FSP1、兔抗E-cad、兔抗α-SMA、兔抗TGF-β1(Abcam公司，美国)；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2造模及分组将30只雄性SD大鼠随机分为对照组8只，模型组22只；正常对照组予以普通饲料喂养，模型组大鼠予以：(1)高脂低蛋白饲料(39.5%玉米面+40%面粉+20%猪油+0.5%胆固醇)；(2)背部皮下注射40%CCl4油剂，首次注射剂量为0.5 ml/100 g体重，以后2次/w，每次注射剂量0.3 ml/100 g体重；(3)以5%酒精为唯一饮料，建立肝纤维化大鼠模型，造模过程中肝纤维化模型组死亡4只大鼠。12 w后随机选取2只大鼠处死，取肝组织行Masson染色方法观察，确定肝纤维化模型复制成功，随机分为肝纤维化模型组8只，益气化瘀化痰养阴剂组8只。

1.3给药方法正常对照组、肝纤维化模型组大鼠均以生理盐水灌胃(1 ml·100 g-1·d-1)，益气化瘀化痰养阴剂组以2 g生药/100 g体重中药制剂灌胃，1次/d，连续观察12 w。

1.4标本采集实验结束后，用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，断头处死大鼠，取部分肝组织用4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，用于Masson胶原三色染色；另取部分肝组织于液氮中冷冻后，转移到-70℃冰箱保存，用于qRT-PCR及Western印迹检测。

1.5形态学观测将肝组织行石蜡切片固定，Masson染色，光镜下观察肝脏病变；电镜下观察肝脏的超微结构改变及胶原纤维沉积的情况。

1.6FSP1、TGF-β1、α-SMA、E-cad mRNA表达的qRT-PCR检测按Trizol说明书提取大鼠肝脏组织总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度，纯度A260/A280在1.8～2.0。按RT-PCR试剂盒说明书取1 μg总RNA逆转录为cDNA。最后以SyBR green作为荧光标记物，进行荧光定量PCR，反应条件：预变性95℃ 3 min，变性95℃ 5 s，退火59℃ 30 s，延伸65℃ 5 s，共40个循环。由上海生工公司设计、合成大鼠FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad的引物。见表1。用CFX Manager Software采集数据，使用目的基因与内参基因的平均ΔCt，采用相对定量法(2- ΔΔCt)法处理得到的数据。

1.7FSP1、TGF-β1、α-SMA、E-cad 蛋白表达的Western印迹检测称取100 mg肝组织于1 ml组织裂解液中冰浴匀浆30 min，4℃离心后取上清，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白量，30 g蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，将目的蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，Tris盐酸缓冲液(TBS)漂洗，加入一抗，4℃孵育过夜。TBS洗膜3次后，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育2 h，洗脱二抗，化学发光检测各组蛋白的表达。应用Bandscan 5.0图像分析软件，定量分析根据目的条带的积分光密度与内参β-actin 密度之比进行。

表1　qRT-PCR 引物序列

2结果

2.1一般情况正常对照组大鼠在实验期间饮食良好，毛发润泽、紧密，活动灵敏，且体重增加明显；肝纤维化模型组大鼠进食减少，毛发暗沉发黄、稀疏，精神差，活动减少，且体重增加缓慢；益气化瘀化痰养阴剂组大鼠一般情况较模型组明显好转，活动趋于正常。

2.2肝组织病理形态学观察

2.2.1Masson三原染色正常对照组大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，细胞无脂肪变及坏死；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏，肝细胞弥漫性脂肪变，胶原纤维沉积，肝纤维化程度明显；益气化瘀化痰养阴剂组大鼠肝小叶结构基本恢复正常，肝组织胶原纤维积聚明显减少，肝纤维化程度明显减轻。见图1。采用METAVIR评分系统将肝纤维化程度分为4级，各组之间纤维化程度差异具有显著差异(F=49.349，P=0.00)。肝纤维化模型组与正常对照组以及益气化瘀化痰养阴剂组与肝纤维化模型组相比，纤维化程度均有显著差异(P<0.05)。见表2。

2.2.2电镜结果正常对照组大鼠肝组织电镜下结构正常，无明显胶原纤维沉积；模型组可见内皮细胞肿胀，血窦内微绒毛肿胀、变性，胆小管扩张，大量胶原纤维沉积；益气化瘀化痰养阴剂组可见肝细胞基本正常，血窦内微绒毛无明显改变，未见明显胶原纤维沉积。见图2。

图2　益气化瘀化痰养阴剂对肝纤维化大鼠肝组织的电镜影响

组别nMETAVIR评分(n)0级1级2级3级4级平均Ridit值正常对照组8800000.240肝纤维化模型组8001610.7821)益气化瘀化痰养阴剂组8431000.4021)2)合计241232610.4751)

与正常对照组比较：1)P<0.05；与肝纤维化模型组比较：2)P<0.05，下表同

2.3大鼠肝组织中FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad mRNA的表达与正常对照组相比，肝纤维化模型组大鼠肝脏FSP1、TGF-β1及 α-SMA mRNA表达显著增强(P<0.05)，E-cad mRNA表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，益气化瘀化痰养阴剂组大鼠肝组织FSP1、TGF-β1及α-SMA mRNA表达明显降低(P<0.05)；E-cad mRNA表达明显升高(P<0.05)。见表3。

表3　各组大鼠肝脏FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad mRNA

2.4大鼠肝组织中FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad蛋白质的表达与正常对照组相比，肝纤维化模型组大鼠肝脏FSP1、TGF-β1及α-SMA 蛋白表达明显增强(P<0.05)，E-cad 蛋白表达明显降低(P<0.05)；与模型组相比，益气化瘀化痰养阴剂组大鼠肝组织FSP1、TGF-β1及α-SMA 蛋白表达显著降低(P<0.05)；而E-cad 蛋白表达显著增强(P<0.05)，其中，FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad 与正常对照组相比差异无统计学意义。见图3，表4。

1：正常对照组；2：肝纤维化模型组；3：益气化瘀化痰养阴剂组 图3　益气化瘀化痰养阴剂对肝纤维化大鼠FSP1、TGF-β1、 α-SMA及E-cad蛋白表达的影响

组别FSP1TGF-β1α-SMAE-cad正常对照组0.31±0.060.37±0.060.58±0.060.82±0.06肝纤维化模型组0.77±0.071)0.96±0.051)0.97±0.061)0.56±0.051)益气化瘀化痰养阴剂组0.46±0.072)0.49±0.042)0.71±0.052)0.73±0.072)

3讨论

EMT是指上皮细胞失去原有的极性和紧密黏附，钙黏附蛋白表达受到抑制、细胞获得移动性。Zeisberg等〔7〕用FSP1作为上皮间质转化的成纤维细胞标志物，证实了肝纤维化中FSP1的表达及迁移，随后他们进一步使用遗传系谱标记技术，利用双转基因小鼠对肝细胞进行追踪，证明了体内肝细胞发生了EMT，参与肝纤维化的形成。EMT涉及的信号通路较多，主要有TGF-β1通路、酪氨酸激酶受体通路及Wnt通路等。其中TGF-β1通路是作用较为明确的通路之一。TGF-β1通过调控下游信号通路smad通路〔6〕，明显促进肝细胞发生EMT，上皮细胞极性消失，间质细胞表达上调，α-SMA、波形蛋白等蛋白表达〔8〕，胶原合成增加，从而促进肝纤维化形成。同时，smad2/3复合体的活化可激活锌指转录因子家族中的snail-1蛋白〔7〕，后者可识别并与E-cad启动子部位结合，抑制E-cad的转录，从而降低细胞内E-cad的水平〔1〕。本实验证实了肝纤维化大鼠肝组织中EMT的发生。

现代中医学认为，肝纤维化属于“血瘀”、“积证”、“胁痛”等病证范畴，其基本证型为气阴虚损、瘀血阻络〔9〕，因此，目前多用活血化瘀、益气养阴为治则治疗肝纤维化。有研究表明，益气活血药黄芪、白术、川芎及姜黄能有效减少肝纤维化大鼠肝组织中炎症因子表达、抑制胶原合成〔10〕；化瘀化痰药半夏、海藻软坚散结，阻止慢性肝损伤向肝纤维化及肝硬化发展；养阴柔肝药白芍、鳖甲可通过减少细胞外基质异常沉积等抑制肝纤维化〔11，12〕。目前实验研究大多只选取益气活血、化瘀化痰或养阴柔肝其中一类药物，而本课题组选用的益气化瘀化痰养阴剂，兼顾三者功效，从多角度抑制肝纤维化的发展。

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〔2014-02-11修回〕

(编辑袁左鸣)