琐琐葡萄多糖对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的影响

琐琐葡萄多糖对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的影响

袁芳徐琦盛磊刘涛1

(新疆医科大学基础医学院，新疆乌鲁木齐830011)

摘要〔〕目的探讨琐琐葡萄多糖(VTP)对β淀粉样蛋白(Aβ25～35)诱导PC12细胞凋亡的影响及作用机制。方法Aβ25～35诱导PC12细胞建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型，VTP(20、40、80 mg/L)作用于细胞模型，CCK-8法检测各组细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，Real-time PCR检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达。结果VTP可提高PC12细胞活性，降低细胞凋亡率，增强Bcl-2 mRNA表达，抑制Bax mRNA表达。结论VTP对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡具有明显的保护作用，其机制可能是通过增强Bcl-2 mRNA表达、降低Bax mRNA表达，抑制细胞凋亡。

关键词〔〕阿尔茨海默病；琐琐葡萄多糖；PC12细胞； Aβ25～35；细胞凋亡

中图分类号〔〕R965.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：刘涛(1974-)，女，博士，教授，主要从事食品毒理研究。

1新疆医科大学公共卫生学院

第一作者：袁芳(1976-)，女，博士，副教授，主要从事维吾尔药物的应用基础研究。

The effects of polysaccharides from Vitis viniferal L on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35

YUAN Fang,XU Qi,SHENG Lei,etal.

College of Basic Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate protective effects of polysaccharide from Vitis viniferal L(VTP) on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35.MethodsAlzheimer's disease(AD) cellmodel was established by Aβ25～35 inducing PC12 cells,then,the cells were divided into control,model(20 μmol/L Aβ25～35) and VTP groups(20,40,80 mg/L).Cell viability was detected by CCK-8 method.The apoptotic rates were examined by Annexin V-FITC.The mRNA expressions of Bcl-2 and Bax were quantified by real-time PCR.ResultsCompared with that of model group,cell viability was improved,the apoptotic rate was reduced in VTP groups(P<0.05),while the expression of Bcl-2 was increased and Bax expression was decreased(P<0.05).ConclusionsVTP inhibits apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35,which might be involved adjust Bcl-2 and Bax gene expression in the mechanism of anti-apoptosis.

【Key words】Alzheimer's disease；VTP；PC12 cells；Aβ25～35；Apoptosis

随着对阿尔茨海默病(AD)研究的深入，天然药物预防和治疗AD的作用日益受到重视。国内外研究显示，葡萄提取物能预防老年痴呆，对原花青素、白藜芦醇等葡萄提取物的抗痴呆作用报道较多〔1,2〕。琐琐葡萄(Vitis vinifera L)主产于新疆吐鲁番、和田等地，是《神农本草经》《维吾尔药志》等医药文献记载的药用葡萄品种。本课题组从琐琐葡萄提取了多糖、黄酮、三萜等活性物质，研究其抗突变、抗氧化、抗病毒、抗衰老等作用〔3〕。本研究拟探讨琐琐葡萄多糖(VTP)抑制神经细胞凋亡的作用及机制。

1材料与方法

1.1药品与试剂VTP按照专利方法(发明专利200710201354)提取分离，刘涛教授馈赠。DMEM培养液溶解，0.22 μm尼龙滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，实验时用完全培养液稀释至所需浓度。Aβ25～35(Sigma公司，超纯水溶解Aβ25～35，置于37℃老化7 d)；DMEM培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Trizol(Invitrogen)；逆转录试剂盒(TaKaRa)，荧光定量试剂(Invitrogen)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BioVision)。

1.2仪器二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，垂直流超净化台(美国Thermo公司)，全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(BD LSRⅡ)，PCR扩增仪(Applied Biosystems)，Real Time PCR System 7700型(美国ABI公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养PC12细胞(高分化)购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。细胞培养液DMEM高糖培养基，含10%灭活胎牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L链霉素，置培养箱(37℃、5%CO2饱和湿度)，隔天换液，3～4 d传代。

1.3.2CCK-8法测定细胞活性对数生长期的PC12细胞，5×104ml接种于96孔板，100 μl/孔。设对照组、模型组、VTP实验组。培养至贴壁后，实验组加入VTP，使其终浓度为20、40、80 mg/L。预处理4 h后，除对照组外，其余各孔加入Aβ25～35，使之终浓度为20 μmol/L。继续培养24 h，每孔加入CCK-8 10 μl，继续培养1 h。在酶标仪450 nm测定吸光度，计算PC12细胞存活率。每组设5个复孔，实验重复3次。

1.3.3流式细胞仪检测细胞凋亡按上述方法分组，培养细胞接种于6孔板，消化各组细胞后收集，1 000 r/min离心5 min，细胞沉淀用冷DMEM洗涤2次，在缓冲液中重悬成单细胞悬液，室温下加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染料，轻轻振荡、混匀，避光孵育15 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.3.4Real-time PCR检测Bcl-2和Bax基因表达按上述方法分组，6孔板培养细胞，Trizol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计分析RNA浓度和纯度。逆转录合成cDNA。逆转录产物cDNA 加入荧光定量PCR反应体系。根据GenBank序列，引物和探针设计软件Primer 5.0设计引物序列。引物序列β-actin：上游引物3′-AGACCTTCAACACCCCAGCC-5′，3′-CGTCAGGCAGCTCATAGCTC-5′，扩增长度362 bp；Bax：3′-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-5′，3′-GCAAAGTAGAAGAGGGCA ACC-5′，扩增长度161 bp；Bcl-2：3′-GTCGCTACCGTCGTGACTT-5′，3′-CAGCCTCCGTTATCCTGGA-5′，扩增长度268 bp。经过Blast分析，引物序列具有特异性。所用的引物及内参照β-actin引物由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。数据采用双标准曲线法处理，计算待测组目的基因相对于对照组的表达差异倍数。

1.4统计学分析采用SPSS18.0软件进行t检验。

2结果

2.1VTP对PC12细胞活性的影响与对照组比较，模型组细胞生长受到抑制，细胞活性下降(P<0.01)；VTP各实验组与模型组比较，细胞活性明显增加(P<0.05)，呈剂量相关性。见表1。

2.2VTP对细胞凋亡的影响对照组细胞凋亡率为4.58%，模型组细胞凋亡率(36.8%)明显升高，加入VTP干预的各组细胞与模型组相比，细胞凋亡率下降，低、中、高剂量组凋亡率分别为17.05%、11.37%、8.96%。

2.3VTP对Bcl-2 mRNA表达的影响模型组与对照组相比，Bcl-2 mRNA表达下降(P<0.01)；VTP各剂量组与模型组相比，Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05)。见表1。

2.4VTP对Bax mRNA表达的影响模型组与正常组相比，Bax mRNA表达增加(P<0.01)；与模型组相比，VTP各剂量组Bax表达降低(P<0.01)。见表1。

表1　VTP对Aβ 25～35诱导的PC12细胞活性及

与对照组相比：1)P<0.01；与模型组相比：2)P<0.05，3)P<0.01

3讨论

Aβ是老年斑的主要成分，AD发病的起始因素是大脑中Aβ的沉积和聚集，发病机制与Aβ的神经毒性作用密切相关〔4〕。在AD动物模型及细胞模型研究中，Aβ25～35诱导损伤建立AD模型是常用方法〔5，6〕。本研究采用20 μmol/L Aβ25～35作用于PC12细胞24 h构建AD体外模型。实验结果表明，模型组细胞活性下降，细胞凋亡率显著增加，显示造模成功，故此模型可以作为评价VTP保护作用的AD细胞模型。

从肉苁蓉、枸杞、黄芪、灵芝等传统益智中药中提取的水溶性多糖均具有显著的改善学习记忆功能；海洋贝类中提取的多糖也具有神经保护活性〔7，8〕。琐琐葡萄中有含量较高的多糖，具有较强的抗氧化能力〔9〕。本研究表明VTP对Aβ25～35诱导的神经细胞凋亡具有保护作用。

神经系统病变与细胞凋亡异常密切相关，在慢性神经退行性病变中，包括AD、帕金森病、Huntington舞蹈病等患者，脑组织中大量的神经细胞丢失，其共同的病理机制是神经细胞的凋亡。AD的发生和发展进程中，诱导异常的细胞凋亡，可导致神经元大量丢失，加重神经细胞病理改变，可导致大脑的学习、记忆能力受到影响〔10〕。异常聚集的Aβ对神经元具有毒性作用，在体内体外均可诱导神经细胞凋亡。因此，在研究AD的防治作用机制时，抗神经细胞凋亡已成为重要作用靶点。与细胞凋亡密切相关的Bcl-2家族基因主要分为抑制凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl基因，以及促凋亡基因Bax和Bad基因。如果促凋亡和抗凋亡基因或相关蛋白之间的平衡被打破，可引起异常神经细胞凋亡，可导致神经元的结构与功能损伤〔11，12〕。本研究结果显示，VTP能减少Aβ25～35诱导的细胞凋亡，提示VTP通过调节凋亡相关基因的表达抑制 Aβ25～35诱导的细胞凋亡。

4参考文献

1Wang J,Ho L,Zhao W,etal.Grape-derived polyphenolics prevent Aβ oligomerization and attenuate cognitive deterioration in a mouse model of Alzheimer’s disease〔J〕.J Neurosci,2008;28(25):6388-92.

2周洁，姜鲜，张红，等.白藜芦醇对 Aβ诱导 PC12 细胞凋亡与线粒体跨膜电位影响〔J〕.中成药，2011;33(11)：1879-82.

3马龙，洪玉，周晓辉，等.葡萄皮提取物抗痴呆作用的研究〔J〕.卫生研究，2006;35(3):30-2.

4Yu W,Mechawar N,Krantic S,etal.Evidence for the involvement of apoptosis-inducing factor-mediated caspase-independent neuronal death in Alzheimer’s disease〔J〕.Am J Pathol,2010;176(5):2209-18.

5杨红旗，李学，蒋秋焕，等.多奈哌齐对Aβ25-35诱导神经毒性的保护作用〔J〕.中华神经医学杂志，2012;11(12)：1209-13.

6He F,Cao YP,Che FY,etal.Inhibitory effects of edaravone in β-amyloid-induced neurotoxicity in rats〔J〕.Biol Med Res Intern,2014;4:1-7.

7陈晓宇，荣延平，焦杨，等.玉郎伞多糖对β淀粉样蛋白所致PC12细胞损伤的影响〔J〕.时珍国医国药，2013;24(4):776-8.

8王大超，侯琳，鞠传霞，等.扇贝糖胺聚糖对六羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用〔J〕.中国药理学通报，2014;30(1)：145-7.

9刘涛，马龙，赵军，等.琐琐葡萄多糖的提取及抗氧化能力研究〔J〕.新疆医科大学学报，2007;30(11)：1230-2.

10Yuan JY，Yankner BA.Apoptosis in the nervous system〔J〕.Nature,2009;40(7)：802.

11Orike N，Middleton G，Borthweick E，etal.Role of PI 3-kinase,Akt and Bcl-2-related proteins in sustaining the survival of neurotrophic factor-independent adult sympathetic neurons〔J〕.J Cell Biol，2011;154(5)：995.

12陈勤，叶海燕，陈逸青，等.红藻氨酸诱导PC12细胞凋亡及阿魏酸对神经元的保护作用〔J〕.中国病理生理杂志，2013;29(7)：1175-80.

〔2014-12-29修回〕

(编辑曲莉)