抑菌圈法研究几种硫酸抗敌素抑菌性能

戴五洲，陈宝国，李顺，郑云林*

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.江西通用技术工程学校）

抑菌圈法研究几种硫酸抗敌素抑菌性能

戴五洲1，陈宝国2，李顺1，郑云林1*

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.江西通用技术工程学校）

本试验旨在研究不同硫酸抗敌素对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌种的抑菌性能。试验选取9块TSA无菌平皿，分成3组，分别做好标记为：大-A、大-B、大-C；沙-A、沙-B、沙-C；葡-A、葡-B、葡-C。用无菌胶头滴管在每块平皿上均匀打6个大小深度相同的孔，每组分别用不同浓度（1600mg/L、800mg/L、400mg/L、200mg/L、150mg/L、100mg/L）的A、B、C 3种硫酸抗敌素检验其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌种的抑菌效果。结果表明：A、B、C三种抗敌素对大肠杆菌、沙门氏菌有抑制效果，对葡萄球菌无明显抑制效果。其中A抗敌素抑菌效果明显好于B、C抗敌素，B、C抗敌素抑菌效果差异不明显。只有A抗敌素在符合国家农业部添加标准的情况下有较好的抑菌效果。

硫酸抗敌素；大肠杆菌；沙门氏菌；金黄色葡萄球菌

硫酸抗敌素又名硫酸黏杆菌素、多黏菌素E，是从多黏芽胞杆菌变种(Bacillus polymyxa var colistimus)培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。其内服不易吸收不易产生耐药性。对革兰氏阳性菌和真菌无作用，治疗时常与抗革兰氏阳性菌的杆菌肤合用；用作饲料添加剂可刺激幼畜生长，提高饲料效率，防止肉鸡、猪、牛等畜禽传染性肠炎；防治大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。硫酸抗敌素应用于断奶仔猪，具有减少仔猪腹泻、促进生长及提高饲料转化率的作用。

国家农业部规定硫酸粘菌素允许添加量为2～20mg/L，而配方师在实践生产中往往超剂量添加，否则达不到抗拉稀效果。本实验旨在通过对市场上硫酸粘菌素含量为10%的预混料产品抑菌性能效果的研究，筛选符合国家农业部法规并且达到抑菌效果的抗生素产品，现论述如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌种由江西农业大学兽医院实验室提供。

1.1.2 试验药品。A、B、C三种硫酸抗敌素均由江西农业大学兽医院实验室提供，含量均≥10%。

1.1.3 实验器械和仪器。器械：试管，烧杯，涂布棒，锥形瓶，玻璃棒，小玻璃瓶，250mL容量瓶，500mL量筒，pH试纸，接种环，20uL、200uL、1 000uL移液枪与枪头，90mm平皿，酒精灯等，均由江西农业大学兽医院实验室提供。

仪器：JN037328型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、HS.Z11.5型电热蒸馏水器（上海跃进医疗器械厂）、DHG-9101.3型电热恒温鼓风干燥箱（扬州市三发电子有限公司）、BS600+型电子天平（上海友声衡器有限公司）、SPX-150Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、SHK-99-11型台式空气恒温摇床（北方同正）、CD-212MBS型冷藏冷冻箱（容声（中国）电器有限公司）、SW-CJ-1F型超净工作台（苏净集团安泰公司）。

1.2 实验的准备

1.2.1 培养基的配制。LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1 000mL。按照培养基配方比例，依次准确称取所需量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl，并准确量取所需体积蒸馏水，置于锥形瓶中，用玻璃棒搅拌可适当加热使药品全部溶化，用NaOH调节pH至7.2～7.6之间。加塞，包扎，115℃高压灭菌30min，室温保存。

1.2.2 无菌平皿的制备。加热使保存的LB固体培养基完全融化，在冷却至50℃左右时倾注于90mm无菌平皿，每平皿约倾注15～20mL，待凝固完全即可使用。

1.2.3 麦氏单位比浊管的配制。选定管径与制备菌液管径相同的试管，量取浓度为1%的稀硫酸9.8mL于选定试管中，另取浓度为0.25%的氯化钡溶液0.2mL缓慢滴加至稀硫酸溶液中混匀，用半径为1cm比色杯在紫外分光光度计上以625nm测定其吸光度值，0.5麦氏单位比浊管的吸光度值应该在0.08～0.1之间为合格，检测合格后封口，4℃保存。比浊管每次使用前用力摇匀，每次使用时复验比浊管浊度。

1.2.4 抗敌素药液的配制。A型抗敌素：称取400mg A型抗敌素，用50mL灭菌蒸馏水溶解，移液至250mL容量瓶，定容至刻度线，配成浓度为1 600mg/L的初始溶液。取6个小玻璃瓶，用移液枪分别移入4mL、2 mL、1mL、0.5mL、0.3mL、0.25mL初始溶液，再用移液枪分别移入0mL、2mL、3mL、3.5mL、2.9mL、3.75mL蒸馏水，配成浓度分别为1 600mg/L、800mg/L、400 mg/L、200mg/L、150mg/L、100mg/L的A型抗敌素药液，分别标记为A1600、A800、A400、A200、A150、A100。

B、C型抗敌素：根据以上同样方法配好浓度分别为1 600 mg/L、800 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、150 mg/L、100mg/L的B、C型抗敌素溶液并标记。

制作完成后用纸盒装好，放入冷藏室冷藏备用。

1.2.5 菌液的制备

1.2.5.1 菌种的复苏。将4℃保存的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌转移至37℃恒温箱中培养一段时间后，使用LB琼脂平皿重新划线接种，37℃恒温培养24h，观察菌落生长情况。

1.2.5.2 菌液的制备。取复壮后的3种菌种，选择外观形态良好的单个菌落钩菌接种至10mL的LB无菌平皿中，37℃振摇培养6～9h，用灭菌的接种环勾取形态良好无污染的菌落分别接种至装有灭菌生理盐水的试管内，稀释到0.5麦氏比浊度，使三种细菌生长浊度达到1×108。将此细菌培养液作为种子液，并在短时间内使用。

1.3 试验菌对3种抗敌素的抑菌圈实验

1.3.1 涂布平皿。取9块TSA无菌平皿，分成3组，分别标记为：大-A、大-B、大-C；沙-A、沙-B、沙-C；葡-A、葡-B、葡-C。用无菌移液枪分别移取三种细菌种子液200uL，根据标记均匀滴到3组无菌平皿内，再用涂布棒涂匀，注意在此过程中注意涂布棒的消毒，避免交叉感染细菌或者感染杂菌。完成后放入37℃恒温箱烘干培养30min。

1.3.2 平皿打孔。取出9块烘干培养后的平皿，用无菌胶头滴管在每块平皿上均匀打6个大小深度相同的孔（如图1、2、3），用酒精灯对每个孔进行烫底。分别对每个孔标号为1、2、3、4、5、6。

图1 A、B、C三种抗敌素对大肠杆菌的抑菌圈实验

图2 A、B、C三种抗敌素对沙门氏菌的抑菌圈实验

图3 A、B、C三种抗敌素对葡萄球菌的抑菌圈实验

1.3.3 接种药物。用20uL无菌移液枪在A号平皿中的1～6号孔分别滴入20 uL的A100、A150、A200、A400、A800、A1600瓶内的抗敌素溶液；同样再在B号平皿中的1～6号孔分别滴入20uL的B100、B150、B200、B400、B800、B1600瓶内的抗敌素溶液;在C号平皿中的1～6号孔分别滴入20 uL的C100、C150、C200、C400、C800、C1600瓶内的抗敌素溶液。其中序号为1、2的孔滴入的为国家农业部规定浓度范围内的抗敌素溶液。

1.3.4 细菌的培养。将涂布好菌液且接种好药物的平皿放入37℃恒温箱培养8～9h。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈试验结果

不同浓度的A、B、C 3种抗敌素对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌抑菌圈实验抑菌圈直径大小值见表1。

2.2 实验结果分析

由1表可知，在国家农业部规定浓度内，A抗敌素对大肠杆菌及沙门氏菌有明显抑菌效果，对葡萄球菌无明显抑菌效果；B、C抗敌素仅在浓度为200 mg/L时对大肠杆菌、沙门氏菌有少许抑菌效果，对葡萄球菌无明显抑菌效果；在浓度为400mg/L、800mg/ L时，A、B、C三种抗敌素对大肠杆菌、沙门氏菌均有明显抑菌效果且A抗敌素效果明显好于B、C抗敌素，对葡萄球菌无明显抑菌效果；在浓度为1 600mg/ L时，A、B、C三种抗敌素抑菌对大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果好且不同药品间无明显差异；A、B抗敌素对葡萄球菌有轻微抑菌效果，C抗敌素对葡萄球菌仍无明显抑菌效果。同时表1表明，抗敌素对革兰氏阴性菌抑菌效果在一定的浓度范围内随着浓度的增大而增大，对革兰氏阳性菌几乎无抑菌效果。

表1 不同浓度的A、B、C三种抗敌素对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌抑菌圈实验抑菌圈直径大小mm

3 讨论

3.1 抑菌性能试验

抑菌性能试验是指在体外测定药物抑菌或杀菌的能力，可为临床选择敏感药物治疗感染性疾病提供依据，也可了解细菌的耐药情况。目前常用方法有抑菌圈法、薄膜密贴法、最小抑菌浓度法和细菌总数测定法等，抑菌圈测量是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成透明圈，即抑菌圈。它是微生物分析的经典方法，有简单、便捷、准确的优点。

3.1.1 影响抑菌性能试验结果的因素

3.1.1.1 菌液的浓度。测定某种细菌对于抗菌药物的敏感性前，首先应将试验菌配制成一定浓度的菌悬液，使最终的试验菌液生长浊度约为1×108。如果菌液浓度过高，则可能导致对该菌敏感的药物也不能抑制其生长或杀灭，使抑菌圈过小而无法筛选出效果更好的药品。

3.1.1.2 培养基的选择。可用于药敏试验分析的培养基种类较多，然而不同的细菌对于培养基的需求不同，本次实验中大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌对培养基营养要求低，在LB固体培养基中生长良好，为了使实验方便同时具有可比性，本次实验3种实验菌均使用LB培养基。

3.1.1.3 细菌培养条件。细菌的生长繁殖除了需要符合要求的营养条件外，还与温度、pH等有关。

温度：温度对于细菌的生长有着极为重要的影响，适合的温度可使细菌迅速生长繁殖。标准实验操作规程中所要求的温度较为固定，一般为37℃。

pH：适合的pH是细菌代谢和繁殖的基本条件，大多数细菌生长的最适pH值为7.2～7.4，因菌种不同略有差异。pH调节应在培养基配制阶段进行，培养基pH不仅影响细菌的生长，同时还可影响药物的稳定性和活性，对试验结果产生影响。例如，在碱性环境中可使氨基糖苷类抗生素的抗菌作用增强[5]。本次实验采用的pH范围在7.2～7.4之间，符合细菌生长繁殖需求，同时对抗菌药物稳定性和活性的影响不大。

3.1.1.4 抗菌药液的配制。硫酸抗敌素易溶于水且理化性质稳定，但是本实验的3种药品粉碎程度和载体度不同，故在配制溶液前应先将其碾压成粉碎度相差不大，在溶液的配制过程中，应使溶质充分溶解。

3.2 细菌的耐药性

几乎每一种细菌接触抗菌药物后都会产生抗菌药物耐药，但在抗菌药物的选择压力下，大部分敏感细菌被杀灭，但少数细菌会发生耐药性变异，以求适者生存。

本次实验结果显示，选用的3种细菌均为对抗敌素无抗药性或者抗药性弱的菌种。

4 结论

A、B、C3种抗敌素对大肠杆菌、沙门氏菌有抑制效果，对葡萄球菌无明显抑制效果。其中A抗敌素抑菌效果明显好于B、C抗敌素，B、C抗敌素抑菌效果差异不明显。只有A抗敌素在符合国家农业部添加标准的情况下有较好的抑菌效果。

[1]杨海峰.硫酸抗敌素研究进展及应用现状[J].兽药与饲料添加剂,2008,03:9～11.

[2]黄强居.硫酸抗敌素在断奶仔猪日粮中的应用[J].当代畜禽养殖业,2010,01:13～14.

[3]周庭银,赵虎.临床微生物学诊断与图解[M].上海科学技术出版社，2001:34～36.

[4]陈杖榴.兽医药理学[M].第三版.中国农业出版社,2009:243.

[5]曾霖.大肠杆菌耐药性的测定[J].江西畜牧兽医杂志,2010,01: 12～14.

1004-2342（2015）02-0010-04

S859.79+6

B

2015-03-26）

戴五洲（1990～），男，江西省永修人，在读硕士，从事动物营养与疾病防控的研究。E-mail：396870216@qq. com。

*通讯作者：郑云林,男，硕士生导师，从事畜禽养殖技术研究。