改良培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的研究

李宏英，李强华

（中牧实业股份有限公司江西生物药厂，江西南昌 330200）

改良培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的研究

李宏英，李强华

（中牧实业股份有限公司江西生物药厂，江西南昌 330200）

为提高仔猪副伤寒活疫苗质量，降低生产成本，使用某培养基生产企业生产的仔猪副伤寒干粉培养基，添加0.75%的水解乳蛋白，配制成合成培养基（以下称改良培养基），用于仔猪副伤寒活疫苗（C500株）的生产，同时与自制培养基进行比较。结果表明，改良培养基培养的活菌数平均达到515×108CFU·mL-1，高于自制培养基水平（450×108CFU·mL-1）；改良培养基生产的6批活疫苗活菌率达50%以上，分别用兔做安全检验、产品经12个月的保存后计活菌数，均符合《中华人民共和国兽药典》2010年版三部[1]的质量要求。试验表明，改良培养基替代自制培养基用于仔猪副伤寒活疫苗（C500株）的生产是可行的，并能降低生产成本。

仔猪副伤寒；改良培养基；菌液活菌数

仔猪副伤寒是由猪霍乱沙门氏菌（almonella choleraesuis）引起的急性、亚急性或慢性传染病，它是一种条件性传染病。主要发生于2～4月龄仔猪，急性病例表现为败血症，慢性病例表现为消瘦和坏死性肠炎。该病全国都有发生，对养猪业的危害很大，预防该病主要使用弱毒活疫苗[3]。《中华人民共和国兽用生物制品操作规程》2000年版[2]（以下简称“规程”）中仔猪副伤寒活疫苗的生产主要采取灌体培养，培养基是由生产企业自行配制的含1%～1.5%蛋白胨的普通肉汤。商品化仔猪副伤寒干粉培养基使用方便，按一定比例加入注射用水配制即可。为保证产品质量，降低生产成本，对仔猪副伤寒干粉培养基进行了改良，分别对改良培养基与自制培养基生产的产品的质量和成本进行了比较。

1 材料

1.1 主要材料

牛肉（自购黄牛肉）、月示蛋白胨（北京奥博星20090902批）、仔猪副伤寒干粉培养基（某厂）、水解乳蛋白（美国BD公司）、猪油（定点购买），葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、明胶、蔗糖，均购自上海国药集团。

1.2 实验动物

普通级大耳白兔，体重1.5～2.0kg，购自定点兔厂。

1.3 检验用培养基

普通琼脂平板、硫乙醇酸盐酸盐培养基、酪胨琼脂培养基、葡萄糖蛋白胨培养基(江西生物药厂)。

1.4 菌种

猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株（CCVCC79500）来自江西生物药厂。

2 方法

2.1 自制培养基生产仔猪副伤寒活疫苗方法

2.1.1 含1 %～1.5%蛋白胨的普通肉汤培养基制备。使用冻冰牛肉、月示蛋白胨、氯化钠，按“规程”要求配制成营养肉汤，使用8%氢氧化钠调节pH7.2～7.6，进罐培养基30×104mL。

2.1.2 培养基在线灭菌液体。培养基使用水泵通过管道打进罐内，加入猪油做消泡剂，116℃灭菌40min。

2.1.3 细菌培养及菌液制备。生产用一级种子和二级种子按“规程”要求进行选育和繁殖，进灌培养按2%的接种量接入二级种子，通气培养，每小时测pH值一次，pH值超过7.5以上时用40%葡萄糖溶液调节pH值，培养至21h结束，使用冷却水冷却后续流高速离心浓缩，收集菌体取样进行纯粹检验和活菌计数，24h后根据活菌计数结果，决定每头份的投入活菌数，加一定比例的明胶蔗糖保护剂，配苗、分装、冻干、轧盖、贴签。

2.2 改良培养基生产仔猪副伤寒活疫苗方法

2.2.1 每次30×104mL，在商品化仔猪副伤寒干粉培养基的基础上按0.75%比例加入水解乳蛋白配成改良培养基，使用8%氢氧化钠或盐酸调pH值7.2～7.4，配制的液体培养基进罐方式和灭菌温度、接种量、培养方式等与自制培养基一致，后续工艺与自制培养基相同。

2.3 用3 批自制培养基生产6批（1001001、1001002、1001003、1001004、1001005、1010006）仔猪副伤寒活疫苗产品，3批改良培养基生产6批（1006022、1006023、1011024、1011025、1011026、1011027）仔猪副伤寒活疫苗产品，对菌液菌数进行活菌计数，冻干后产品依据《中华人民共和国兽药典》2010年版[1]依次进行安全检验、活菌计数、冻干后活菌率及保存期试验，比较两种培养基的生产成本。

3 结果

3.1 各产品生产和检验结果

改良培养基生产的仔猪副伤寒活疫苗C500株，菌液活菌数达到自制培养基生产的水平，冻干后的11批产品依次进行安全检验、活菌计数、冻干后活菌率检验，结果均符合要求（表1）。

表1 11批产品生产、检验结果

3.2 冻干产品保存期试验

对改良培养基生产的6批仔猪副伤寒活疫苗产品保存12个月后进行活菌计数，每头份含菌数在3.0×109CFU以上，均达到《中华人民共和国兽药典》2010年版[1]要求,为制定该产品内控质量标准提供技术参数（表2）。

表2 改良培养基生产产品保存期试验结果

3.3 生产成本分析

以2010年的原材料价格为例，使用改良培养基，大幅度降低了生产成本，并且节约了煮牛肉的蒸汽的能耗，减轻生产人员的劳动强度，节省劳动力成本（表3）。

表3 自制培养基与改良培养基成本对比

4 讨论

有关仔猪副伤寒活疫苗生产培养基多有报道，张金平等[4]仔猪副伤寒（C500株）培养菌数比较试验显示,分别进行仔猪副伤寒C500通气培养试验,生产了16批疫苗,其平均培养活菌数为456×108CFU/ mL；马振宇等[5]仔猪副伤寒活疫苗半合成培养基的配方筛选试验表明，用半合成培养基生产该产品，平均培养活菌数为421×108CFU/mL，本试验结果表明,平均培养活菌数均高于以上试验结果。

自制培养基需要采购牛肉，冷冻储存，牛肉价格高，并且价格一直在攀升，来源不同，质量难以保证。配制培养基前需提前融化冰冻的牛肉，粉碎加工、浸泡、煮汤、过滤等需要3d的时间才能完成，生产周期长。商品化的仔猪副伤寒干粉培养基，购买方便，添加0.75%水解乳蛋白就可以配制而成改良培养基，按比例加入注射用水溶解、煮沸，使用8%氢氧化钠或盐酸调pH值即可使用。它具有保存条件要求低、使用简便的优势，并便于生产计划的调整，降低人员劳动强度，节省人力资源成本。

本试验通过改良培养基对仔猪副伤寒C500株进灌培养试验效果的分析,研制出比“规程”所用自制培养基更优的改良培养基,并用此培养基制备的6批疫苗菌液活菌数均高于自制培养基,产品冻干后活菌率均高于50%,安全检验及其他项目均检验合格,产品保存期试验结果均达到《中华人民共和国兽药典》2010年版[1]要求,并达到了自制培养基的水平；生产成本远远低于自制培养基,仅占自制培养基的1/3，并节省了人力，因此，改良培养基替代自制培养基用于仔猪副伤寒活疫苗（C500株）的生产是可行的。

[1]中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典[S].2010年版（第三部）．

[2]中华人民共和国兽用生物制品操作规程[S].2000年版，164～166，附录399～400.

[3]王明俊主编.兽用生物制品学[M].中国农业出版社，1997，481.

[4]张金平，孙继强，杨丽平，等.仔猪副伤寒（C500株）培养菌数比较试验[C].中国畜牧兽医学会生物制品学会分会第十次学术研讨会论文集，2005，222～224.

[5]马振宇，张大鹏，刘欣，等.仔猪副伤寒活疫苗半合成培养基的配方筛选试验[J].中国兽药杂志,2005,39(4):13～14.

1004-2342（2015）01-0016-02

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2014-11-27）