碳氮源及pH调控对假肠膜明串珠菌产甘露醇的影响

朱婧，吴昊，任心怡，张敏，马江锋，姜岷

（南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816）

碳氮源及pH调控对假肠膜明串珠菌产甘露醇的影响

朱婧，吴昊，任心怡，张敏，马江锋，姜岷

（南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816）

为了降低生物法制备甘露醇的成本，以假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides G123为研究对象，对培养基中的氮源、葡萄糖与果糖比例和pH调控过程进行了优化，提高了果糖转化率和甘露醇产量。5L发酵罐中结果显示：采用2g/L的酵母粉作为单一氮源，葡萄糖和果糖的比例为0.35∶1，初始pH值7.5，发酵过程中保持pH值不低于4.5，甘露醇产量可达57.24g/L，甘露醇对果糖的转化率为83.2%。该过程副产D-乳酸20.32g/L，其光学纯度达99.9%，具有回收价值，甘露醇与D-乳酸对糖总转化率为89.38%，有助于降低生物法制备甘露醇的成本。

甘露醇；氮源；pH调控；D-乳酸

甘露醇是六碳糖醇化合物，广泛应用于食品、制药、医药和化学品等领域[1-2]。甘露醇的甜度只有蔗糖的一半[2]。相比其他糖类，如蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖，甘露醇具有低热量的优点[3]，同时甘露醇在代谢过程中不需要胰岛素的参与，是糖尿病人食品甜味剂的最佳替代品。目前，工业上生产甘露醇主要通过化学法，在高温高压条件下以镍作为催化剂催化葡萄糖和果糖（1∶1）的混合物和氢气来合成。催化合成的化合物中甘露醇只占总量的25%，其余75%都是副产物山梨醇，而将甘露醇与副产物分离的过程中会产生较高的成本和更低的收率[1，3]。Mochihiro等[4]指出，在此工艺过程中结晶甘露醇的收率只有初糖的17%。微生物法合成甘露醇具有绿色清洁、反应条件温和、没有山梨醇生成等优点而得到广泛关注。

异型乳酸菌是生产甘露醇的良好菌株，如乳酸杆菌属、明串珠菌属和酒球菌属[5]。这些菌株可利用甘露醇脱氢酶（mannitol 2-dehydrogenase，MDH）将果糖还原为甘露醇，同时生成副产物乳酸、乙酸、CO2和乙醇，而且这些副产物很容易就能跟甘露醇分开。当异型乳酸菌在厌氧条件下以葡萄糖和果糖（0.5∶1）的混合糖为碳源时，菌株会以葡萄糖作为主代谢碳源，同时产生NAD(P)H和ATP，而果糖会消耗NAD(P)H并还原为甘露醇[5]。值得一提的是，明串珠菌属在生产甘露醇时，副产物中的乳酸往往是 D-型结构[6]，D-乳酸作为一个手性中心，是多种手性物质的前体，广泛应用于医药、高效低毒农药除草剂及化妆品等领域的手性合成[7]，目前90%含量的D-乳酸市场售价达到4万元/吨，具有较高的附加值。

目前异型乳酸菌生产甘露醇对碳氮源的需求较高，Yun等[8]研究了Leuconostoc sp. Y-002代谢各种不同碳源发酵产甘露醇的结果，发现只有加入果糖和蔗糖时才能产甘露醇，在加入10g/L酵母粉的情况下，以50g/L果糖发酵25h得到20g/L甘露醇。Soetaert等[1]以150g/L果糖和75g/L葡萄糖作为碳源分批发酵Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291，60h后果糖转化率为90%，但需要加入10g/L胰蛋白胨和10g/L酵母粉作为氮源。Kim等[9]研究了L.pseudomesenteroides NRRL B-1149在不同果糖浓度下分批和补料分批对产甘露醇的影响，分批发酵加入50g/L果糖产率最高，得39g/L甘露醇，通过补料分批发酵对果糖（200g/L）的转化率可达 89.5%，但仍然需要添加 5g/L酵母粉和5g/L蛋白胨。pH值是影响甘露醇合成的另一因素，菌体在代谢糖时会产生大量乳酸，使pH值不断下降，影响了发酵后期菌体的生长和代谢，Saha等[10]控制发酵pH值恒定在5.0，Yue等[11]采用了两阶段控制pH值，先控制pH值在5.5，利于菌体的生长，再控制pH值在4.5，利于甘露醇的合成。本文对假肠膜明串珠菌L.pseudomesenteroides G123发酵制备甘露醇的碳氮源和pH调控进行了初步优化研究。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Leuconostoc pseudomesenteroides G123由本实验室自主筛选诱变得到，中国典型培养物保藏中心（武汉大学）CCTCC2014115。

1.1.2 培养基

种子培养采用MRS培养基（g/L）：果糖20，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，CH3COONa 5，C6H5O7(NH4)32，K2HPO4·3H2O 2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，吐温80，pH值自然，121℃灭菌15min。

发酵培养基（g/L）：总糖浓度90，有机氮源1～5，K2HPO4·3H2O 26，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，FeCl3·H2O 0.01，CaCl20.02，NaCl 0.01，初始pH值 6.0～7.5，121℃灭菌15min。

1.2 方法

1.2.1 培养条件

种子液培养条件：将保存于−80℃的菌株，接入到装液量为5mL的种子培养基试管中，接种量1%[12]，于30℃、200r/min摇床中培养12～14h，作为一级种子液。再将一级种子液转接到 500mL三角瓶中，装液量为 120mL，接种量 1%，于 30℃、200r/min培养8～10h，作为二级种子液。

血清瓶培养条件：100mL血清瓶装液量30mL发酵培养基，接种量6%，通入无菌过滤的N22min，200r/min培养36h。

5L发酵罐（KF-5Lfermentor;KoBio Tech. Co. Ltd.）培养条件：装液量为 2L发酵培养基，接种量6%，于30℃、搅拌转速150r/min、全程通N2保持厌氧环境至菌株停止消耗葡萄糖，初始pH值为7.5，待其降低至某一pH值（4.5～5.5）时，以20%NaOH维持该pH值至发酵结束。定时取样测定菌体密度（OD600）和葡萄糖浓度，离心保存上清液，检测试样中的甘露醇、果糖、乳酸。

1.2.2 分析方法

菌体密度的测定：用紫外分光光度计（Spectrumlab 752S）在 600nm 处测定吸光值OD600。

葡萄糖浓度的测定：用生物传感分析仪（SBA 240C，山东省科学院生物研究所）测定。

果糖和甘露醇浓度的测定：色谱柱为 Benson BP-100 Pb++，以纯水作为流动相，流速0.4mL/min，柱温80℃，用示差折光检测器检测。

乳酸浓度的测定：色谱柱为 Aminex HPX-87H[13]，以5mmol/L H2SO4作为流动相，流速0.6mL/min，柱温55℃，用紫外检测器检测，检测波长为215nm[14]。

D-乳酸光学纯度的测定：用高效液相色谱法进行测定[15]。

2 结果与讨论

2.1 培养基的初始pH值对发酵性能的影响

MRS培养基的自然pH值在7.0左右，假肠膜明串珠菌具有一定的产酸能力，初始需要微碱性环境[16]，降低氮源总量时，不可避免地会改变培养基的自然pH值条件，本实验考察了培养基初始pH值 6.0～8.0对发酵性能的影响，初始总糖浓度90g/L（葡萄糖和果糖比例为0.5∶1），培养基其余成分同种子培养基，30℃，血清瓶厌氧培养24h，发酵结果如图1所示。

由图1可知，菌体生长性能（DCW为细胞干重）与甘露醇产量随着培养基初始pH值升高逐渐提升，当初始pH值为7.5时，甘露醇产量最高，达到 44.09g/L，但在发酵终止后，不同条件下的pH值均维持在4.0左右（数据未给出）。故确定血清瓶培养时，培养基初始pH值为7.5。

2.2 氮源种类及用量对发酵性能的影响

种子培养基含有酵母膏、蛋白胨和牛肉膏等丰富昂贵的氮源，为了降低氮源成本，首先考察了不同氮源组合对发酵性能的影响，总氮源为5g/L，分别添加5g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，2.5g/L蛋白胨加2.5g/L酵母粉，培养基其余成分同发酵培养基，并与对照的MRS培养基作比较，在总糖浓度为90g/L，葡萄糖和果糖的比例为 0.5∶1，初始 pH值为 7.5条件下血清瓶30℃厌氧培养36h，结果如图2所示。

图2 不同氮源组合对发酵结果的影响

由图2可知，当用5g/L酵母粉作为单一氮源时，甘露醇浓度最高，为46.40g/L，甚至优于对照MRS培养基。而单一使用或部分使用蛋白胨作为氮源时，甘露醇产量均明显低于酵母粉，这可能是由于蛋白胨中没有足够的氨基酸和维生素。因此选择酵母粉作为唯一氮源开展进一步优化。

为了进一步降低氮源用量，分别考察了不同酵母粉添加量（1～5g/L）对发酵产甘露醇的影响，结果如图3所示。

由图3可知，随着酵母粉用量的减少，生物量明显下降，但当酵母粉用量＞1g/L时，甘露醇和D-乳酸的产量变化不显著，其中加入2g/L酵母粉得到的甘露醇为40.49g/L，比加入5g/L酵母粉时仅减少了0.94%，说明在一定底物浓度范围内，酵母粉用量减少虽然不利于菌体的生长，但对甘露醇的产量影响不大。因此将氮源添加量优化为2g/L酵母粉，比MRS培养基减少了90%的有机氮源用量。

图3 不同酵母粉添加量对发酵结果的影响

2.3 碳源中葡萄糖和果糖的比例对发酵性能的影响

本实验考察了不同葡萄糖和果糖比例对发酵性能的影响，在初糖浓度 90g/L，葡萄糖和果糖比例分别为1∶1、0.5∶1、0.35∶1和0.25∶1，培养基氮源为2g/L酵母粉，其余成分同发酵培养基，初始pH值为7.5，血清瓶30℃厌氧培养36h，发酵结果如表1所示。

表1 不同比例的葡萄糖和果糖以及纯果糖对发酵结果的影响

由表1可知，葡萄糖和果糖的比例为0.35∶1时，甘露醇产量最高，达41.06g/L，其对果糖的转化率也最高，达到 88.82%，对总糖的转化率为66.11%。而葡萄糖含量较高时，均有大量葡萄糖残留。在厌氧发酵混合糖时，明串珠菌可以同时消耗葡萄糖和果糖，假肠膜明串珠菌主要利用葡萄糖作为产酸和产辅酶途径，但由于明串珠菌消耗果糖的速度比葡萄糖快[17]，菌体会将部分果糖转化为6-P-葡萄糖用于获取能量，并产生NADH用于合成甘露醇。所以果糖比例过高反而会降低甘露醇的转化率。上述结果表明在总糖浓度一致的情况下，合适的葡萄糖和果糖比例会提高甘露醇对果糖的转化率，本文确定培养基中葡萄糖和果糖的比例为0.35∶1。

2.4 不同pH调控策略对发酵结果的影响

血清瓶发酵结果表明，假肠膜明串珠菌发酵终止时的pH值在4.0左右，过低的pH值会抑制菌体的耗糖和生长[18]。有报道表明，合理的pH调控可以有效地提高菌体的耗糖和甘露醇产量[5]。通过上罐发酵，分别将pH值控制在4.5、5.0和5.5（总糖浓度为90g/L），结果如图4～图7所示。

图4 pH调控对假肠膜明串珠菌G123生长的影响

图5 pH调控对假肠膜明串珠菌G123消耗葡萄糖的影响

图6 pH调控对假肠膜明串珠菌G123消耗果糖的影响

图7 pH调控对假肠膜明串珠菌G123产甘露醇和乳酸的影响

如图4所示，菌体在0～24h处于对数期，此时的耗糖和产甘露醇速率较快，但甘露醇对果糖的转化率均低于静止期（表 2），说明有部分果糖转化为6-P-葡萄糖，进入PK途径，尤其是pH值5.5时，甘露醇对果糖的转化率仅75.1%。菌体在静止期中的耗糖和产甘露醇速率明显降低，但静止期所产的甘露醇占甘露醇总产量的 22.1%～29.7%，说明甘露醇的生成属于部分生长相关型。pH值控制在5.0和5.5时，发酵至48h，果糖均已消耗完（图6），而pH值4.5时，发酵在52h终止，甘露醇产量达57.24g/L，分别比pH值控制在5.0和5.5提高了1.03倍和1.06倍。可见高pH值环境有利于菌体消耗底物，而甘露醇适合在低pH值环境下合成。由此可见：发酵pH值控制在4.5时产甘露醇较好，甘露醇对果糖的转化率为 83.2%，产乳酸20.32g/L，经检测不含L-乳酸，D-乳酸光学纯度达99.9%，甘露醇和 D-乳酸对总糖的转化率为89.38%。

表2 pH调控在对数期和静止期对假肠膜明串珠菌G123产甘露醇和乳酸的影响

3 结 论

通过考察假肠膜明串珠菌G123生产甘露醇的性能及对碳氮源的优化，有效地减少了培养基有机氮源用量，保证了甘露醇对果糖的转化率，并通过对pH调控过程的优化，提高了碳源的利用率与甘露醇产量。结果表明：在5L发酵罐中，采用2g/L的酵母粉作为单一氮源，总糖浓度90g/L，葡萄糖和果糖的比例为0.35∶1，初始pH值7.5，发酵过程中控制pH值不低于4.5，发酵52h，甘露醇产量达到57.24g/L，甘露醇对果糖的转化率为83.2%，并副产 D-乳酸 20.32g/L，D-乳酸光学纯度达99.9%，具有回收价值，甘露醇和D-乳酸对总糖的转化率为89.38%，有助于降低甘露醇的生产成本。

[1]Soetaert W，Vanhooren P T，Vandamme E J. The production of mannitol by fermentation[J]. Carbohydrate biotechnology protocols，1999，10：261-275.

[2]Von Weymarn N，Hujanen M，Leisola M. Production of D-mannitol by heterofermentative lactic acid bacteria[J]. Process Biochemistry，2002，37：1207-1213.

[3]Von Weymarn N，Kiviharju K，Leisola M. High-level production of D-mannitol with membrane cell-recycle bioreactor[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2002，29：44-49.

[4]Iijima M，Mochihiro T，Osada Y，et al. Process for preparing D-mannitol：US，19760749623[P]. 1978-04-11.

[5]Saha B C，Nakamura L K. Production of mannitol and lactic acid by fermentation with Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J]. Biotechnology and Bioengineering，2003，82：864-871.

[6]Soetaert W，Buchholz K，Vandamme E. Production of D-mannitol and D-lactic acid by fermentation by Leuconostoc mesenteroides[J]. Agro Food Industry Hi-Tech，1995，6（1）：41-44.

[7]Tokiwa Y，Calabia B P. Biodegradability and biodegradation of poly (lactide)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72：244-251.

[8]Yun J W，Kim D H. A comparative study of mannitol production by two lactic acid bacteria[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering，1998，85（2）：203-208.

[9]Kim C Y，Lee J H，Kim B H，et al. Production of mannitol using Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1149[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2002，7（4）：234-236.

[10]Saha B C，Racine F M. Effects of pH and corn steep liquor variability on mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87：553-60.

[11]Yue M，Cao H，Zhang J，et al. Improvement of mannitol production by Lactobacillus brevis mutant 3-A5 based on dual-stage pH control and fed-batch fermentations[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2013，29：1923-30.

[12]梅佳军，张常青，刘嵘明，等. 利用改性载体固定化大肠杆菌产琥珀酸[J]. 化工进展，2013，32（1）：161-165.

[13]徐蓉，奚永兰，张九花，等. 利用纤维素水解液中的纤维二糖发酵制备丁二酸[J]. 化工进展，2013，32（4）：874-877.

[14]Saha B C. A low-cost medium for mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J]. Applied Microbiology And Biotechnology，2006，72：676-80.

[15]丁子建，柏中中，孙志浩，等. 芽孢乳杆菌发酵葡萄糖制备D(-)-乳酸的研究[J]. 生物加工过程，2004，2（3）：30-36.

[16]杨晓晖，籍保平，李博，等. 泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究[J]. 食品科学，2005，26：130-134.

[17]Carvalheiro F，Moniz P，Duarte L C，et al. Mannitol production by lactic acid bacteria grown in supplemented carob syrup[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2011，38：221-227.

[18]金红星，史建波，成文玉，等. 以蔗糖为原料明串珠菌发酵生产甘露醇[J]. 食品与发酵工业，2011，37（2）：91-93.

Effect of carbon and nitrogen source and pH control strategy on mannitol production by Leuconostoc pseudomesenteroides G123

ZHU Jing，WU Hao，REN Xinyi，ZHANG Min，MA Jiangfeng，JIANG Min
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

A new mutant strain Leuconostoc pseudomesenteroides G123 was investigated in this study. The nitrogen source，the ratio of glucose and fructose and the pH control strategy were optimized to reduce the cost of mannitol production. Batch fermentations were operated in a 5L fermentor.The results showed that 57.24g/L mannitol was produced with the mannitol yield of 83.2% when 2g/L yeast extract was chosen as the single nitrogen source，the ratio of fructose toglucose was 0.35∶1，and the initial pH was controlled at 7.5 and kept constant at 4.5 in the later phase. Besides，20.32g/L D-lactic acid with optical purity of 99.9% was also produced which suggested it could be recovered as a by-product. The yield of mannitol and lactic acid to the total sugar was 89.38%. As a result，the cost was reduced efficiently.

mannitol; nitrogen source; pH control strategy; D-lactic acid

TQ 923

A

1000-6613（2015）12-4333-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.12.033

2015-03-13；修改稿日期：2015-04-25。

江苏高校优势学科建设工程项目（PAPD）及新世纪优秀人才支持计划（NCET-12-0732）项目。

朱婧（1990—），女，硕士研究生。联系人：姜岷，教授。E-mail bioengine@njtech.edu.cn。