Clostridium saccharobutylicum DSM 13864细胞表面理化特性及固定化细胞产丁醇的性能

陈强，董晋军，许国超，韩瑞枝，倪晔

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864细胞表面理化特性及固定化细胞产丁醇的性能

陈强，董晋军，许国超，韩瑞枝，倪晔

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

糖丁基梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864能利用多种糖类为底物发酵产丁醇。本文研究了该菌体细胞表面的理化特性，并以砖块作为细胞固定化材料进行丁醇发酵。采用细菌吸附有机溶剂（MATS）法证明糖丁基梭菌细胞表面有强烈的亲水性，并且等电点在pH值为3左右，这些特性有利于菌体与表面亲水多孔的砖块吸附。在60g/L葡萄糖发酵培养基中，以5～8目砖块作为固定化材料，流速为1.1L/min，发酵48h后，丁醇的浓度、得率和生产率分别达到11.02g/L、0.18g/g和0.23g/(L·h)，相比悬浮细胞发酵分别提高了10.53%、5.88%和9.52%。结果表明：砖块作为一种固定化材料可有效提高糖丁基梭菌的发酵产丁醇水平。

糖丁基梭菌；丁醇；固定化；细菌吸附有机溶剂；砖块

丙酮丁醇发酵工业曾经是仅次于乙醇发酵工业的第二大发酵产业。由于石油工业的发展，发酵法生产丙酮丁醇逐渐被淘汰。但随着人类对石油资源逐年增长的消费需求，发酵法产丁醇又重新引起人们的重视[1]。丁醇作为一种新型的能源，和乙醇相比，具有以下优点：与汽油调和的配伍性更好，能量密度和燃烧值更高，蒸汽压较低，可经石油管道运输，腐蚀性小，水溶性低等[2]。由于高浓度的丁醇对细胞膜的磷脂结构有破坏作用，从而影响细胞代谢，抑制菌体生长[3]。因此，近年来许多研究集中于降低发酵液中丁醇浓度和提高菌种的丁醇耐受性[4]。

在过去的几十年中，已报道的用于降低发酵液中丁醇浓度、降低生长抑制、提高溶剂生产率的主要方法包括：吸附[5]、液-液萃取[6]、渗透蒸发[7]和汽提[8]。另外，研究证明细胞固定化在丁醇生产中能够提高细胞密度，增强发酵稳定性和提高溶剂耐受性等[9]。用于固定化细胞研究的载体包括：角叉菜胶-壳聚糖[10]、藻酸钙[11]、纤维素材料[12]（如甘蔗渣、纤维固定床）等。Yen等[13]在ABE分批发酵中使用砖块作为固定化材料，丁醇终浓度增加了3.60%，Chen等[9]使用毛巾作为固定化材料，实现分批发酵中丁醇浓度提高了 26.19%，丁醇得率达0.20g/g。Vichuviwat等[14]使用沸石-13X，丁醇浓度达到8.58g/L，较对照提高了62.19%。

在本文作者研究室的前期研究中，建立了 C. saccharobutylicum的两级半发酵体系，成功运行 8天，平均生产率（第二级）达 1.05g/(L·h)[15-16]；以玉米桔杆水解液为底物进行了四级连续发酵，连续运行 220h，溶剂生产率和溶剂得率分别达到0.43g/(L·h)和 11.43g/L[17]。然而，以上研究皆基于悬浮细胞发酵，为进一步提高C. saccharobutylicum发酵产丁醇的浓度、得率和生产率，有必要选择一种合适的固定化材料。本文首先研究了 C. saccharobutylicum细胞表面的理化特性，然后选择砖块作为固定化材料进行了该菌株固定化细胞的发酵产丁醇研究。

1 实验材料和方法

1.1 实验菌种

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864，购自德国微生物和细胞保藏中心（DSMZ）。

1.2 培养基

种子培养基（RCM 培养基）：酵母膏3g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉1g/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，NaCl 3g/L，NaAc 3g/L，pH值6.5，115℃灭菌20min。

TYA培养基：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L， K2HPO42g/L，pH值 6.5，115℃灭菌20min。

葡萄糖发酵培养基：葡萄糖 60g/L，玉米浆干粉10g/L，CaCO34.0g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO40.5g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，pH值 6.0，115℃灭菌20min。

1.3 实验方法

1.3.1 种子培养

室温保藏的菌种孢子悬液以10%的接种量转接于RCM培养基中，37℃厌氧培养 12～18h。

1.3.2 细胞亲疏水性

活化后的种子液以8%的接种量接种到TYA培养基中，37℃静止培养，分别收集处于对数期和稳定期的菌体，离心后悬浮于磷酸钾缓冲液（0.1mol/L，pH值 6.0）中，维持初始OD400（A0）在0.8～1.0之间。将4.8mL菌悬液分别与0.8mL溶剂（氯仿、正十六烷、乙酸乙酯和癸烷）在旋涡振荡仪上充分混合90s，静止15min后分层，取水相样品，在400nm下测定吸光值A。吸附率计算公式为式（1）。

1.3.3 电泳迁移率测量

在对数中后期（OD600～3.0）收集细胞，离心后悬浮于磷酸钾缓冲液（0.1mol/L，pH值 6.0）中，维持初始吸光值OD400（A0）在0.8～1.0之间，用0.1mol/L HCl或者 NaOH调节上述菌悬液 pH值2～8，采用纳米粒度电位仪Zetasizer Nano-ZS（伍斯特，英国）检测电泳迁移率。

1.3.4 固液比优化

把来自于本地建筑工地的砖块碾碎后筛选 5～8目大小的颗粒，用去离子水清洗数次，121℃灭菌1h，烘干待用。在装有 150mL葡萄糖培养基的250mL摇瓶中分别加入40g、60g、80g和100g处理后的砖块，接种后静置培养于37℃培养箱，以不加砖块培养基作为对照。48h后检测发酵结果。

1.3.5 吸附实验

在稳定期收集细胞，将离心获得的菌体用磷酸钾缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮于相同的磷酸钾缓冲液中，维持初始OD600在0.8～1.0之间，将盛有 110g砖块的 250mL血清瓶通过两条硅胶管与150mL血清瓶连接，形成循环流通体系，将275mL菌悬液缓慢加入到150mL血清瓶，通过蠕动泵使菌悬液流入整个体系，并保持菌液循环流速为1.1L/h，每0.5h从体系中取出2mL菌液检测OD600。实验结束后的砖块样品用于电镜扫描。

1.3.6 固定化细胞发酵稳定性实验

砖块60g加入装有150mL葡萄糖发酵培养基的250mL带硅胶管血清瓶中，接种48h后，使用蠕动泵抽干发酵液，再泵入新鲜培养基，然后静置培养，每48h重复一次，一共进行10个循环。每次取样5mL用于检测。

1.3.7 细胞固定化发酵

在装有1.5L葡萄糖培养基的3L发酵罐中接种150mL种子培养液，恒温37℃培养。当细胞生长达到对数中期（OD600约2.0）时，将固定化装置通过灭菌的硅胶管连接到发酵罐上，并用蠕动泵保持循环流速为1.1L/h。固定化装置为盛有600g无菌砖块的玻璃容器（i. d. 70mm×250mm，250mL工作体积），整套装置连接如图1所示。

图1 细胞固定化发酵装置示意图

1.3.8 分析方法

吸光度测定：OD400和 OD600使用分光光度计（上海菁华）测定。

糖含量：葡萄糖浓度采用SBA-40C生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）测定。

溶剂和有机酸：溶剂（丙酮、乙醇、丁醇）和有机酸（乙酸、丁酸）的测定采用气相色谱法（GC）。毛细管色谱柱：PEG-20M（30m× 0.32mm×0.5μm）。柱温条件：初始60℃，保持0.5min 后，以10℃/min的速度升至 120℃，保持 0.5min后，以 15℃/min的速度升至 150℃，保持 0.5min后，以 20℃/min的速度升至190℃，保持1min。进样口温度180℃，FID检测器温度210℃，进样量1.0μL，分流比90∶1。尾吹流速29mL/min，H2流速30mL/min，空气流速300mL/min。

2 结果与分析

2.1 C. saccharobutylicum细胞表面理化特性

细菌吸附有机溶剂（MATS）法由 Bellon-Fontaine等[18]首先应用，是基于微生物碳氢吸附能力法改进而来的用于检测细胞亲疏水性的方 法。MATS法可以测定微生物对不同极性溶剂附着力中路易斯酸碱（i. e.电子供体和电子受体）的相互作用。因此，MATS法是基于比较微生物对具有相同范德华力的单极溶剂（电子供体或者电子受体）和非极性溶剂的亲和力差异。本工作选择了 Bellon-Fontaine等所使用的溶剂：氯仿（电子受体溶剂）和正十六烷（非极性溶剂），乙酸乙酯（电子供体溶剂）和癸烷（非极性溶剂）。图2显示两个生长阶段的C. saccharobutylicum细胞对不同溶剂的附着力，包括：氯仿、正十六烷、乙酸乙酯和癸烷。由图 2可见，C. saccharobutylicum细胞对氯仿表现出最高的附着力，对乙酸乙酯的附着力最低。说明菌体具有较强烈的电子供体特征（路易斯碱），微弱的电子受体特征（路易斯酸），即C. saccharobutylicum细胞的强碱弱酸特征较为显著。另外，细胞对两种非极性溶剂的亲和力较低，说明菌体具有强烈的亲水性，而且对数期细胞的亲水性要强于稳定期。当水或者亲水性液体（如甘油、PEG 200等）滴到砖块表面后，液滴能在砖块表面迅速地铺展开，说明砖块表面浸润性良好，有较好的亲水性，有利于亲水性菌体的吸附。

图2 不同生长阶段的C. saccharobutylicum细胞的有机溶剂附着力分析

电泳迁移率通常反映细胞表面的带电荷情况。本文测定C. saccharobutylicum细胞在不同pH值环境下的电泳迁移率。图3反映了稳定期细胞在不同pH值的0.1mol/L磷酸钾缓冲液中的电泳迁移率。菌体的等电点在pH值为3左右，且当pH值大于3时菌体带负电。这种现象和其他革兰氏阳性菌等电点类似[19]，主要是由于细胞壁中磷壁酸的磷酸二酯键基团或者磷脂中的磷酸聚合基团（R—H2PO4/R—HPO42−）（pKa约等于 2.1）和肽聚糖 COOH/COO−（4

图3 C. saccharobutylicum细胞的电泳迁移率测定

2.2 砖块固定化C. saccharobutylicum细胞的稳定性

如图4结果所示，每150mL发酵培养基加入60g砖块时，丁醇和总溶剂浓度均达到最高，分别为11.1g/L和 16.0g/L，相比悬浮细胞发酵分别提高了15.6%和17.6%。因此，在随后的实验也采用相同的固液比例。根据砖块吸附率计算，约65%的细胞在循环4.5h之后被吸附到砖块颗粒上（如图5）。如电镜照片图6(a)显示，未固定化砖块表面粗糙，有众多的褶皱，因此具有较大的菌体有效接触面积。而固定化后[图6(b)]，载体褶皱表面已被菌体覆盖，菌体在载体表面能生长和分裂，并保持活力。稳定性实验结果显示（图7），丁醇浓度保持在10g/L以上，总溶剂稳定在15g/L以上，表明吸附于砖块表面的菌体在发酵液的更换过程中一直保持活性。在以后的分批发酵应用中，可以省去种子培养的过程，可降低发酵成本，提高生产效率。

图4 150mL溶液中砖块添加量对C. saccharobutylicum发酵产丁醇的影响

图5 C. saccharobutylicum细胞的砖块吸附时间进程曲线

图6 C. saccharobutylicum细胞吸附到前后的砖块表面电镜照片

图7 砖块固定化C. saccharobutylicum 细胞的10个循环重复分批发酵

2.3 砖块固定化C. saccharobutylicum细胞发酵产丁醇

在3L发酵罐中研究固定化细胞对ABE发酵的影响。如图8所示，在固定化发酵40h后，丁醇和总溶剂终浓度为11.02g/L和16.55g/L，丁醇生产率和得率分别为0.23g/(L·h)和0.18g/g。而对照组（悬浮细胞发酵）中，丁醇和总溶剂浓度分别为9.97g/L和15.54g/L，丁醇生产率和得率分别为0.21g/(L·h)和 0.17g/g。固定化发酵丁醇和总溶剂终浓度较对照组分别提高了10.53%和6.80%；丁醇的生产率和得率较对照组分别提高了9.52%和5.88%。与其他报道相似，与悬浮细胞相比，固定化细胞通常能提高丁醇生产率[21]。本工作首次采用砖块作为载体固定化C. saccharobutylicum细胞。表1汇总了近年来固定化梭菌发酵产丁醇的研究，砖块、离子交换树脂amberlite[22]和毛巾[23]都是表面亲水的载体，能吸附表面亲水的梭菌，而沸石13X在发酵液pH值环境下表面带正电[24]，能与同样环境下带负电的菌体在静电力作用下相结合，因此都是良好的固定化材料。但是和砖块固定化 C. acetobutylicum BCRC 10639 和C. beijerinckii TISTR 1461相比，本工作中丁醇生产率更高，约为C. beijerinckii TISTR 1461的2倍。和离子交换树脂amberlite及沸石相比，砖块是一种更加易得和便宜的材料。另外，砖块的预处理很简单，不需要化学处理。虽然采用毛巾作为固定化材料能得到相对较高的生产率和得率[9，25]，但是毛巾在长期的操作中容易染菌，并且回收过程繁琐。而砖块只需要清洗数次，烘干后便能再次使用。值得注意的是，固定化细胞发酵残糖浓度低于对照组。固定化细胞发酵结束时，残糖浓度为1.9g/L，而对照组中残糖浓度为 5.3g/L，这可能是因为在带有固定化循环装置的体系中培养基的利用更为充分。

图8 砖块固定化C. saccharobutylicum的发酵时间进程曲线

表1 固定化梭菌细胞分批发酵产丁醇研究的比较

3 结 论

通过研究 C. saccharobutylicum细胞的表面特性，以砖块为固定化材料初步探索了固定化对丁醇发酵的影响，得出以下主要结论。

（1）通过 MATS检测法证明了 C. saccharobutylicum细胞表面具有强碱弱酸的特性，有强烈的亲水性，并且等电点在pH值为3左右，这些特征有利于与亲水表面的砖块相结合。

（2）摇瓶发酵实验中，当150mL葡萄糖培养基加入60g砖块时，丁醇和总溶剂达到最高，相比悬浮细胞发酵分别提高了15.6%和17.6 %，电镜图片证明砖块表明细胞吸附效果明显，稳定性实验表明固定化后的菌体能保持细胞活性。

（3）3L发酵罐发酵实验中，丁醇的终浓度为11.02g/L，较对照组提高了10.53%；丁醇生产率和得率分别为0.23g/(L·h)和0.18g/g，较对照组分别提高了9.52%和 5.88%。表明砖块作为固定化材料可进一步应用于连续发酵实验中。

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Enhanced butanol production by Clostridium saccharobutylicum DSM 13864: Physicochemical property and immobilization

CHEN Qiang，DONG Jinjun，XU Guochao，HAN Ruizhi，NI Ye
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864 is a solventogenic strain capable of producing ABE solvents (acetone，butanol and ethanol) from various saccharides. To validate its potential in ABE fermentation with cell immobilization，the physicochemical properties of C. saccharobutylicum DSM 13864 cells were investigated. The microbial adhesion to solvents (MATS) analysis shows that the cell surface is hydrophilic due to its strong electron-donating property，and negatively charged at pH above 3. Brick was used as an immobilization material in ABE fermentation with C. saccharobutylicum. At a flow rate of 1.1L/min through the immobilized C. saccharobutylicum，the titer and yield of butanol reached 11.02g/L and 0.18g/g respectively，and butanol productivity was 0.23g/(L·h) in batch fermentation，representing improvements of 10.53%，5.88% and 9.52% compared with free cell fermentation，respectively. The results suggest that cell immobilization with brick is efficacious in enhancing butanol production by C. saccharobutylicum.

Clostridium saccharobutylicum; butanol；immobilization; microbial adhesion to solvents (MATS); brick

Q 815

A

1000-6613（2015）12-4214-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.12.014

2015-03-18；修改稿日期：2015-04-16。

国家 973计划（2011CB710800）及国家自然科学基金（21276112，31401634）项目。

陈强（1989—），男，硕士研究生。联系人：倪晔，教授，主要研究方向为生物催化和酶工程。E-mail yni@jiangnan.edu.cn。