丙酮丁醇梭菌高耐丁醇突变株的选育及其生理特性的研究

毛绍名，章怀云

丙酮丁醇梭菌高耐丁醇突变株的选育及其生理特性的研究

毛绍名，章怀云

（中南林业科技大学 林业生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）

丁醇在发酵培养基中的积累所产生的毒性问题是限制丁醇产量的重要因素，然而对于如何提高丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum丁醇耐受性，目前尚缺乏有效的方法。利用紫外线-氯化锂复合诱变技术获得了一株丁醇的耐受性提高了46%的丙酮丁醇梭菌突变株M6，通过比较野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6在不同丁醇胁迫条件下的生理特性，发现突变株M6比野生型菌株具有更好的抵抗丁醇胁迫能力；进行控制pH的分批发酵研究发现，突变株M6的溶剂总产量提高了21.3%，其中丁醇和丙酮的产量分别提高了30.4%和8.3%。表明能够通过紫外线-氯化锂复合诱变技术将C. acetobutylicum高耐受丁醇和高产丁醇的性能集中于同一菌株，这为选育既耐受较高浓度的丁醇又高产丁醇的工业化C. acetobutylicum菌株奠定了基础。

丙酮丁醇梭菌；丁醇；突变株；丁醇耐受性

进入21世纪后，石油资源紧缺而导致的石油价格持续上涨已成为不可逆转的趋势。随着石油资源的耗竭和温室效应等环境问题的日益突出，高效利用可再生原料生产能源和化学品已成为全球关注的重点之一。醇类是一类重要的平台化学品，其中大部分醇可以通过微生物发酵转化，因此醇类被认为是极具发展潜力的生物燃料和生物基化学品[1]。

丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂或用作溶剂、萃取剂等，丁醇又是一种极具发展潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道、不易吸水，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合[2]。所以，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料。

发酵法生产丙酮丁醇曾经是仅次于乙醇的全球第二大发酵工业。随着石油价格的不断上涨，丁醇发酵工业已迎来复苏产业的大好时机。目前，利用微生物发酵生产丁醇面临的问题是发酵后期高浓度丁醇对细胞的毒性，丁醇毒性是其工业化大规模生产所面临的最关键的问题，提高丁醇耐受性将极大的提高丁醇产量[3-5]。以前已经有利用传统技术和目标代谢工程技术来提高丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum醇耐受性的报道。如：研究者通过在15-18g/L丁醇条件下驯化培养，筛选到了两株丁醇耐受突变菌C. acetobutylicum SA-1[6]和G1[7]。在C. acetobutylicum中过表达表达热激蛋白groESL操纵子显著能增强宿主的丁醇产量和耐受性[8-9]。另外，在C. acetobutylicum ATCC 824中过表达spo0A基因能增强C. acetobutylicum丁醇耐受性并且在丁醇胁迫条件下能延长细胞代谢[10]。Zhu, L.等利用代谢工程技术在C.acetobutylicum DSM 1731中表达谷胱甘肽合成酶基因gshAB引入谷胱甘肽合成系统，能显著提高菌株的丁醇耐受性和产量[11]。

本研究利用紫外线-氯化锂复合诱变技术对C.acetobutylicum DSM 1731进行诱变，并筛选出高耐受丁醇的突变株，获得了一株丁醇的耐受性和丁醇产量显著性提高的突变菌株M6，通过比较野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6在不同丁醇胁迫条件下的生理特性，并通过控制pH的分批发酵对野生型菌株和突变株进行了代谢流的分析，从而对突变株M6丁醇耐受性及发酵特性进行评价。通过研究突变菌株生理代谢特性，对该菌株的丁醇耐受能力和丁醇生产能力进行探讨，为选育既耐受较高浓度的丁醇又高产丁醇的工业化菌株提供新的思路，为以后利用可再生资源生产化工原料丁醇及开发燃料丁醇奠定了坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 菌种及培养基

菌种：C. acetobutylicum DSM 1731购自德国DSMZ菌种保存中心。

培养基：Reinforced clostridial medium (RCM)[12],Clostridial growth medium (CGM)[13]。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化

用浸过70%酒精的脱脂棉擦净装有C.acetobutylicum DSM 1731菌种的安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，再滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，接着吸取0.3～0.4 mL无菌的液体RCM培养基[12]滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。取约0.2 mL菌体悬浮液，移植于固体的RCM培养基[12]平板上，并在厌氧培养操作系统BACTRONⅡ-2中37℃厌氧培养；剩余的菌液加入至10 mL液体RCM培养基[12]中，并在75℃水浴中热激10 mim，然后37℃厌氧培养。

1.2.2 紫外线-氯化锂复合诱变选育高耐丁醇突变株

使用紫外线-氯化锂复合诱变技术选育高耐受丁醇的突变株M6。首先将C. acetobutylicum DSM 1 731种子接种到50 mL液体RCM培养基中[12]，并在75℃水浴中热激10 min，然后37℃厌氧培养12 h；当菌体生长至OD600= 2.0时，3 000×g离心10 min收集菌体；然后将菌体重悬至含有0.1 mol的磷酸钾缓冲液 (pH7.0) 中；取菌体稀释液加入至无菌的培养皿中，将加有菌悬液的培养皿放置于30W的紫外灯（事先预热30 min）下，距离20 cm处进行照射诱变。取不同诱变时间（60 、90、120、150和180 s）的处理液，将紫外诱变后菌液稀释涂布于不同浓度的氯化锂（氯化锂浓度是4 、8 、12和16 g/L）固体RCM培养基 (RCM+ 2%琼脂) 平板上，黑暗避光37℃厌氧培养。用无菌的0.1 mol的磷酸钾缓冲液 (pH7.0)将诱变后固体RCM培养基平板上长出来的菌落洗下来，收集菌体悬液；将菌体悬液均匀涂布到不同浓度的丁醇固体RCM培养基 (RCM + 2%琼脂) 平板上，37℃厌氧培养48 h；对不同浓度的丁醇固体RCM培养基平板上长出来的突变菌株进行丁醇耐受性和产量的检测；最终筛成功选到了一株能在19 g/L丁醇平板上生长的并且丁醇产量提高生物突变株M6。

1.2.3 C. acetobutylicum DSM 1731及其高突变株的丁醇耐受性比较

在平板上挑取C. acetobutylicum DSM 1731及其突变株M6单克隆接种分别到10 mL液体RCM培养基[12]中，并在75℃水浴中热激10 min，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600=0.8时，将菌体转接至400 mL液体CGM[13]培养基中，37℃厌氧培养；当菌体生长至指数生长期OD600=1.0±0.05时 (大约 12 h)；培养物被均分成4等份 (100 mL/份)，分别用0、6、12和18 g/L丁醇进行胁迫处理；对C. acetobutylicum DSM 1731和M6在不同丁醇浓度胁迫下的生长状态进行监测。

1.2.4 C. acetobutylicum DSM 1731及其高突变株的发酵实验

大规模发酵实验在BioFlo 110 发酵罐 (NBS公司) 中进行。首先在平板上挑取C. acetobutylicum DSM 1731及其突变株M6单克隆分别接种到10 mL液体RCM培养基[12]中，并在75℃水浴中热激10分钟，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600= 0.8时，将菌体转接至液体CGM[13]培养基中厌氧培养作为种子液；当种子液菌体生长至OD600= 0.2时，按5%的接种量接种到含有4 L液体CGM (80 g/L葡萄糖) 培养基的BioFlo 110发酵罐中进行发酵实验；通过充氮气 (流速50 mL/min) 维持发酵罐中厌氧环境；发酵起始pH大约是6.5，通过补加6 mol 氨水来控制菌体发酵pH维持在5.0。

1.2.5 发酵后代谢产物的检测

C. acetobutylicum DSM 1731及其突变株M6发酵后的代谢产物（乙酸、丁酸、丙酮、丁醇、乙醇等）使用高效液相色谱 (High performance Liquid Chromatography, HPLC) 分离鉴定。首先将发酵过程中取出的样品10 000×g离心5 min，取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES（SLGP033RB）0.22 µm针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent 1 200 HPLC(Agilent Technologies公司) 系统，用0.05 mmol稀H2SO4作为流动性，流速0.50 mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H 离子交换柱 (7.8×300 mm，Bio-Rad公司)，柱温控制在15℃，在30℃使用示差折光检测器 (Refractive index (RI) detector) 进行信号检测。

2 结果

2.1 紫外线-氯化锂复合诱变技术选育高耐受丁醇的突变株

本研究采用物紫外线-氯化锂复合诱变技术对Clostridium acetobutylicum DSM 1731进行诱变，并在含不同浓度丁醇的固体RCM培养基上进行突变株的筛选，得到一株能在19 g/L丁醇的固体RCM培养基上稳定生长的突变株M6，该突变株相对于原始菌株DSM 1731，其丁醇耐受性提高了46%。因此有必要将突变株M6进行下一步的生理特性的研究分析。

2.2 C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6的丁醇耐受性比较

将生长到指数生长期 (OD600= 1.0±0.05) 的野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6细胞在6 g/L，12 g/L，18 g/L丁醇中进行胁迫处理，并监测其生长曲线 (图 1)。从图中生长曲线我们能看出野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6在没有丁醇胁迫环境下生长没有显著性差异 (图 1A)。野生型菌株C.acetobutylicum DSM 1731能在6 g/L和12 g/L丁醇中生长，然而，对比突变株M6，野生型菌株DSM 1731的生长受到丁醇强烈抑制（图 2B和2C）。突变株M6能在12 g/L和18 g/L丁醇中生长的比较稳定，但是生长也受到了部分抑制（图2C和2D）。野生型菌株DSM 1731完全不能在18 g/L丁醇中生长，生长被完全抑制；在后期DSM 1731开始死亡，而突变株M6的生长比较稳定。这些结果清晰地展示出突变株M6在丁醇胁迫下具有更优的生长表现，能够耐受更高浓度的丁醇，具有更好的丁醇耐受性特征。

2.3 C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6发酵特性

为了获得突变株M6更多的生理学特征，在BioFlo 110 发酵罐 (NBS公司) 中进行控制pH (pH＜5.0) 分批发酵C. acetobutylicum DSM 1731和突变株M6实验。分别进行了两次生物学重复试验取平均作为最终结果，发酵结果见图 2。突变株M6在发酵过程中丁醇的最高产量达到16.01 g/L，相对于野生型DSM 1731丁醇的产量提高了30.4% (图2A和图 2 B)；M6在发酵过程中丙酮的最高产量是3.51 g/L，相对于野生型菌株丙酮的产量提高了8.3% (图 2A和图 2B)；M6在发酵过程中乙醇的最高产量是1.45 g/L，相对于野生型菌株丙酮的产量下降了16.2% (图 2A和图 2B)；其中M6的溶剂总产量达到20.84 g/L，相对于野生型菌株提高了21.3%。突变株M6的丁酸最高产量达到5.87 g/L高于野生型菌株DSM 1731的3.1 g/L。野生型菌株DSM 1731快速利用葡萄糖导致其在接种后24 h后迅速产生代谢物 (图 2A和2C)。然而，突变株M6直到接种后30 h才开始产生代谢物 (图 2B)。突变株M6丁醇平均产率最高达到22.7%，比野生型菌株DSM 1731丁醇平均产率提高了35.4%(图2D)。突变株M6丁醇的产量提高了30.4%，这可能是由于在控制pH的分批发酵中，野生型菌株DSM 1731只产生了3.1 g/L丁酸，而M6产生了5.87 g/L丁酸，在突变株M6中过多的丁酸在发酵后期被迅速转化成丁醇从而导致大量的丁醇积累，从图 2B中可以看出在54 h，突变株合成丁醇量达到最高值，同时丁酸的产量也达到一个低值0.67 g/L。

图1 野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731（空心正方形）和突变株M6 （实心正方形）在不同浓度丁醇下的生长曲线(A)：0 g/L丁醇；(B)：6 g/L丁醇；(C)：12 g/L丁醇；(D)：18 g/L丁醇Fig. 1 Growth profiles of the wild type strain DSM 1731 (open squares) and the mutant M6 (solid squares) challenged with different concentration of butanol

图2 野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731 (A)和突变株M6 (B) 分批发酵曲线 (pH＜5.0)(C)：葡萄糖的利用曲线；(D)丁醇平均产率曲线；DSM 1731 (空心圆) 和M6 (实心圆)Fig. 2 Time-courses of the batch fermentations (pH ＞ 5.0) of (A) the wild type strain DSM 1731 and (B) the mutant M6

3 讨 论

紫外线是一种使用最早、延用最久、效果明显的物理诱变剂。紫外线诱变频率高，操作简单、而且不易回复突变。氯化锂是一种碱金属卤化剂，其本身无诱变作用，但在诱变育种中表现出与一些诱变因子例如紫外线具有协同效应，氯化锂在一定浓度范围内，有利于菌体正突变的发生[14]。诱变剂的复合处理有一定的协同诱变效应，能增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对微生物育种具有重要的意义。

以前已经有很多利用传统技术 (如：自然驯化，诱变育种) 来提高C. acetobutylicum丁醇耐受性的报道。如：研究者通过在15-18g/L丁醇条件下驯化培养，筛选到了两株丁醇耐受突变菌C.acetobutylicum SA-1[6]和G1[7]。Baer等通过经典的化学诱变C. acetobutylicum ATCC 824获得一株丁醇耐受菌株C. acetobutylicum SA-2能在18g/L丁醇中生长，然而SA-2只能产生痕量的丁醇[15]。这些结果暗示提高丁醇的耐受性并不能相应的提高菌株的丁醇产量。Formanek等[10]利用化学诱变技术筛选到一株能产生19 g/L丁醇的拜氏梭菌C. beijerinckii strain BA101。 在 C. acetobutylicum ATCC 824中过表达spo0A基因能增强宿主对丁醇的耐受性并延长代谢[10]。研究者还通过失活ATCC 824菌中的buk（丁酸激酶基因）能产生16.7 g/L丁醇[16]。此外，在失活solR基因的C.acetobutylicum ATCC 824菌中增强adhE1基因的表达能提高丁醇的产量 (17.6 g/L)[17]。本研究所获得的突变株不但丁醇的耐受性提高了46%，而且丁醇的产量也提高了30.4%。

本研究将紫外线-氯化锂复合诱变技术应用到工业梭菌遗传育种中。证明了能够通过紫外线-氯化锂复合诱变技术将C. acetobutylicum高耐受丁醇和高产丁醇的性能集中于同一菌株。这为选育既耐受较高浓度的丁醇又高产丁醇的工业化C.acetobutylicum菌株提供新的思路，为以后利用可再生资源生产化工原料丁醇及开发燃料丁醇奠定了坚实的基础。

4 结 论

丁醇毒性是ABE（Acetone-butanol-ethanol）发酵中丁醇产量的限制性因素，研究表明提高细胞对丁醇的抗性会提高丁醇产量[3-5]。本研究通过紫外线-氯化锂复合诱变技术获得了一株丁醇耐受性提高了46%的C. acetobutylicum 突变株M6。并对C. acetobutylicum DSM 1731及其突变株M6在不同丁醇浓度下进行耐受性比较研究，结果显示突变株M6具有更好的丁醇耐受性特征，其丁醇耐受性提高了46%。最后，通过控制pH的发酵来研究突变株M6和野生型菌株DSM 1731的生理学特征，发现突变株M6的溶剂总产量提高了21.3%，其中丁醇和丙酮的产量分别提高了30.4%和8.3%。

[1] Zhang Y, Zhu Y, Li Y. The importance of engineering physiological functionality into microbes[J]. Trends Biotechnol.,2009, 27(12): 664-672.

[2] Durre, P. Biobutanol: an attractive biofuel[J]. Biotechnol. J.,2007, 2(12): 1525-1534.

[3 Ezeji T C, Qureshi N, Blaschek H P. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors[J]. Curr. Opin.Biotechnol., 2007, 18(3): 220-227.

[4] Lee S Y, Park J H, Jang S H, et al. Fermentative butanol production by Clostridia[J]. Biotechnol. Bioeng., 2008, 101(2):209-228.

[5] Liu S, Qureshi N. How microbes tolerate ethanol and butanol[J].N Biotechnol, 2009, 26(3-4): 117-121.

[6] Lin Y L, Blaschek H P. Butanol production by a butanol-tolerant strain of Clostridium acetobutylicum in extruded corn broth[J].Appl. Environ. Microbiol., 1983, 45(3): 966-973.

[7] Soucaille P, Joliff G, Izard A, et al. Butanol tolerance and autobacteriocin production by Clostridium acetobutylicum[J].Curr. Microbiol., 1987, 14(5): 295-299.

[8] Tomas C A, Beamish J, Papoutsakis E T. Transcriptional analysis of butanol stress and tolerance in Clostridium acetobutylicum[J].J. Bacteriol., 2004, 186(7): 2006-2018.

[9] Tomas C A, Welker N E, Papoutsakis E T. Overexpression of groESL in Clostridium acetobutylicum results in increased solvent production and tolerance, prolonged metabolism, and changes in the cell’s transcriptional program[J]. Appl. Environ.Microbiol., 2003, 69(8): 4951-4965.

[10] Formanek J, Mackie R, Blaschek H P. Enhanced butanol production by Clostridium beijerinckii BA101 grown in semidefined P2 medium containing 6 percent maltodextrin or glucose[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63(6): 2306-2310.

[11] Zhu L, Dong H, Zhang Y, et al. Engineering the robustness of Clostridium acetobutylicum by introducing glutathione biosynthetic capability[J]. Metab. Eng., 2011, 13(4): 426-434.

[12] Hirsch A, Grinsted E. Methods for the growth and enumeration of anaerobic spore-formers from cheese, with observations on the effect of nisin[J]. J. Dairy Res., 1954, 21: 101-110.

[13] Wiesenborn D P, Rudolph F B, Papoutsakis E T. Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the synthesis of acids and solvents[J]. Appl. Environ. Microbiol.,1988, 54(11): 2717-2722.

[14] 吴红艳, 郑喜群, 姚 蕤. 紫外线-氯化锂复合诱变选育羧肽酶高产菌株[J]. 中国调味品, 2004(6): 15-17.

[15] Baer S H, Blaschek H P, Smith T L. Effect of butanol challenge and temperature on lipid composition and membrane fluidity of butanol-tolerant Clostridium acetobutylicum[J]. Appl. Environ.Microbiol., 1987, 53(12): 2854-2861.

[16] Harris L M, Desai R P, Welker N E, et al. Characterization of recombinant strains of the Clostridium acetobutylicum butyrate kinase inactivation mutant: need for new phenomenological models for solventogenesis and butanol inhibition?[J].Biotechnol. Bioeng., 2000, 67(1): 1-11.

[17] Harris L M, Blank L, Desai R P, et al. Fermentation characterization and flux analysis of recombinant strains of Clostridium acetobutylicum with an inactivated solR gene[J]. J.Ind. Microbiol. Biotechnol., 2001, 27(5): 322-328.

Study on screening the butanol-tolerant mutant of Clostridium acetobutylicum and its physiological characteristics

MAO Shao-ming, ZHANG Huai-yun
(Hunan Province Key Lab. of Forestry Biotechnology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Butanol toxicity is the major barrier for cost-effective fermentative production of butanol. Currently, there is no effective method to raise the butanol tolerance of C. acetobutylicum. UV Ray and Lithium Chloride were used to generate a strain of C.acetobutylicum mutant M6 which made butanol tolerance enhance by 46%. The comparative physiological analysis was carried out between C. acetobutylicum DSM 1731 and its mutant M6 with different butanol stress, and it was found that M6 had a higher butanol tolerance that the former. By batch fermentation experiments with pH control, and it was found that the solvent, butanol and acetone production of mutant M6 increased by 21.3%, 30.4% and 8.3% as compared to the wild type strain DSM 1731, respectively. The results indicate that UV Ray and Lithium Chloride composite mutation can accumulate the higher butanol tolerance of C. acetobutylicum, and improve butanol production. The data will be useful for further breeding the higher butanol tolerance and butanol production of industrial strain.

Clostridium acetobutylicum; butanol; mutant strain; butanol tolerance

S785；S798；Q936

A

1673-923X (2012)08-0103-05

2012-03-28

国家自然科学基金（31140014）;中南林业科技大学引进高层次人才科研启动基金（104-1068）;中南林业科技大学校青年基金（QJ2011003A）

毛绍名（1982—），男，湖南怀化人，博士，讲师；研究方向：林业生物技术；E-mail: msm526@163.com

章怀云（1951—），教授,研究方向：生物技术； 电话: 0731-85623479; E-mail: huaiyunzhang@126.com

[本文编校：邱德勇]