美洲型和欧洲型PRRSV一步法二重RT-PCR快速检测方法的建立和应用

于新友，李天芝，王金良，唐 娜，李 峰，沈志强，

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

美洲型和欧洲型PRRSV一步法二重RT-PCR快速检测方法的建立和应用

于新友1，李天芝1，王金良2，唐 娜2，李 峰2，沈志强1，2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

根椐GenBank中已发表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）2种病毒基因序列，分别设计2对引物。在建立2种病毒单项一步法RT-PCR检测方法的基础上，优化一步法二重RT-PCR反应条件，建立了2种病毒的一步法二重RT-PCR检测方法，用这2对引物对同一样品中的美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV核酸模板进行一步法二重RT-PCR扩增，结果可同时扩增美洲型PRRSV的265 bp和欧洲型PRRSV的451 bp的特异性片段，而对其他4种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该方法能检出10 pg的美洲型PRRSV和10 pg的欧洲型PRRSV模板。通过对175份临床病料检测，将建立的一步法二重RT-PCR技术和单项一步法RT-PCR方法进行对比验证，结果显示，两者的总符合率为100%。表明建立的一步法二重RT-PCR检测方法，具有特异、快速、准确的特点，可用于对美洲型和欧洲型PRRSV的同时检测和鉴别诊断。

美洲型PRRSV；欧洲型PRRSV；一步法二重RT-PCR；检测

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种接触性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。已被国际兽疫局列为需要通报的B类传染病。PRRS最早于1987年在美国发生，荷兰于1991年首次分离到PRRSV。此后，该病相继在主要养猪国家发生，现已呈世界性分布，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。自1996年我国分离到首株PRRSV以来，该病已先后在全国多个省市地区暴发和流行。按照血清型和遗传性差异，PRRSV可划分为欧洲型和美洲型。最初，欧洲型主要流行于欧洲地区，美洲型主要流行于美洲及亚太地区。目前，两种基因型已经被鉴定在欧洲、北美和亚洲同时存在。我国流行的致病株主要以美洲型PRRSV为主，但是近年来也有欧洲型PRRSV致病的报道。我国每年从英国和法国等欧洲国家进口种猪占进口种猪总数的40%左右，然而，关于欧洲型PRRSV的报道却很少。为调查我国美洲型和欧洲型PRRSV流行情况，同时减少2个亚型检测的工作量，根据GenBank上已发表的美洲型PRRSV N基因、欧洲型PRRSV ORF5的基因序列，分别设计了2对能特异性扩增欧洲型和美洲型PRRSV的引物，建立了可同时检测欧洲型和美洲型PRRSV的一步法二重RT-PCR方法，为这2种病毒亚型临床快速检测和流行病学调查等提供了有效的技术平台。

1  材料和方法

1.1 病毒株与病料

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、流行性乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存，临床检测病料为2012年1月—2014年12月采自山东省各地猪场临床诊断为PRRSV感染的猪的肺脏、脾脏等。

1.2 工具酶及试剂盒

pMD18-T载体、限制性内切酶、PCR相关试剂、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，AxyPrep体液病毒DNA/ RNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.3 RT-PCR引物设计与合成

用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照GenBank中登录的美洲型PRRSV N基因序列（AY150564）设计1对引物，扩增美洲型PRRSV N基因片段大小为265 bp，引物序列如下：NAF：5′-GCCCCATT TCCCTCTAGCGA-3′，NAR：5′- ACACATTCTCCCAATTCTA ACA-3′。参照GenBank中登录的欧洲型PRRSV ORF5基因序列（AY588319）设计1对引物，扩增欧洲型PRRSV ORF5基因片段大小为451 bp，引物序列如下：EUF：5′-CGGCGACAGCTCGACATA -3′，EUR：5′-CCCTTCGAGG ACGACATG-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒基因组RNA的提取

按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书提取美洲型和欧洲型PRRSV的RNA，并提取其他几种病毒的核酸。

1.5  一步法二重RT-PCR扩增及条件优化

最适退火温度的确定：分别以50、52、53、54、56、58、60 ℃的退火温度进行梯度一步法二重RT-PCR反应，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度。

最适引物浓度的确立：在25 ul PCR反应体系中分别加入各对引物，使引物浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 μmol/L，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳引物浓度，筛选出一步法二重RT-PCR反应体系的最佳反应模式。

1.6  特异性试验

分别提取美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV的核酸，用已建立的一步法二重RTPCR方法进行扩增。

1.7 敏感性试验

分别提取美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV的RNA后定量，分别作10倍梯度稀释提取的病毒基因组RNA，每个稀释度取l μL为模板，采用已优化的一步法二重RT-PCR反应条件分别对上述不同稀释度的RNA 进行一步法二重RT-PCR扩增，反应结束后进行凝胶电泳检测，以检测建立的一步法二重RT-PCR的敏感性。

1.8 重复性试验

用建立的一步法二重RT-PCR检测方法分别对美洲型PRRSV感染的10份阳性样品，欧洲型PRRSV感染4份阳性样品及5份阴性样品重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.9 临床样品的检测

取PRRSV疑似送检病料175份，利用建立的一步法二重RT-PCR方法进行检测。

2  结果与分析

2.1 反应条件的优化

通过对美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV 2种引物浓度及一步法二重RT-PCR扩增温度、时间和循环次数等的优化，最后确定一步法二重RT-PCR中最佳引物浓度分别为美洲型PRRSV 0.5 μmol/L、欧洲型PRRSV 0.5 μmol/L。一步法二重RTPCR的最佳反应模式为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，最后 72 ℃ 延伸10 min。

2.2 扩增产物的检测

将美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的核酸分别进行一步法二重RT-PCR扩增，结果能扩增出与试验设计相符，美洲型PRRSV的265 bp，欧洲型PRRSV的451 bp的特异性片段，而对照扩增不出任何条带（图1）。

图1 单项一步法RT-PCR扩增结果

2.3 特异性试验

用建立的一步法二重RT-PCR方法对美洲型PRRSV与欧洲型PRRSV混合样品、美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV在相同的条件进行扩增。结果显示，美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的RTPCR产物的片段长度分别为265 bp和451 bp，与预期大小一致，而CSFV、JEV、PPV、PRV均未扩增出片段（图2），说明本研究建立的一步法二重RTPCR方法特异性强。

2.4 敏感性试验

用紫外分光光度计测定的模板RNA浓度，依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取1 μL作为模板。结果显示用10 pg的美洲型PRRSV和10 pg的欧洲型PRRSV作为模板该一步法二重RTPCR仍然可以扩增出特异性条带（图3）。

2.5 重复性试验

经过3次重复操作，结果一致，表明本研究建立的一步法二重RT-PCR方法是稳定可靠的。

图2 特异性试验

图3 敏感性试验

2.6 临床样品的检测

对175份在山东省不同地区采集的PRRSV疑似病料，用建立的一步法二重RT-PCR和单项一步法RT-PCR进行了检测，两者符合率达100%，检出美洲型PRRSV阳性样品95份，欧洲型PRRSV阳性样品4份。

3  讨论

参照GenBank中登录的美洲型PRRSV N基因序列（AY150564）和欧洲型PRRSV ORF5基因序列（AY588319），利用Primer Premier5.0分别设计1对引物，通过一步法RTPCR扩增出目的基因，分别连接到pMD18-T载体，送样测序，对测序结果与模板序列进行比对，其同源性均为100%，本试验确定的一步法二重RT-PCR中最适引物浓度分别为美洲型PRRSV 0.5 μmol/L、欧洲型PRRSV 0.5 μmol/L时，达到最佳反应效果。反复优化多重PCR的反应参数，尤其要注意PCR反应的退火温度要足够高，因为一步法二重RT-PCR反应体系中有多对引物，退火温度过低往往会导致非特异性扩增产物出现，提高退火温度则可有效减少非特异性扩增产物的生成，通过反复摸索条件，所确定的一步法二重RT-PCR中最适退火温度为54 ℃。特异性试验结果显示，本试验所建立的一步法二重RT-PCR检测美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV的方法分别能够扩增出265 bp和451 bp片段，而对常见的猪病病毒如CSFV、JEV、PPV、PRV均无扩增产物，证明本方法具有很好的特异性。敏感性试验结果显示，对美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV的检测灵敏度均可以达到10 pgRNA。

通过对175份PRRSV疑似病料检测结果显示，单项一步法RT-PCR与一步法二重RT-PCR检测方法结果的符合率为100%。可以在一份样品中同时检测出美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV两种病原体，达到对美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的同步诊断，比单项扩增减少65%的时间和1/2的试剂，该法敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低，适合基层兽医工作者使用。为国内美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的鉴别诊断和流行病学调查等提供一种简单、快速的分子生物学诊断方法。

略。

2015-01-13）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-011-14)；山东省自然科学基金青年基金项目（ZR2014CQ010）

于新友(1983-)，男，汉族，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究。

Email：yuxinyou_2006@126.com