大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞原代培养方法的改进

孟立平，蒋承建，赵飞，郭艳，池菊芳，郭航远

（1.绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院 心内科，浙江 绍兴 312000；2.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；3.浙江中医药大学 研究生院，浙江 杭州 310000）

·技术与方法·

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞原代培养方法的改进

孟立平1，2，蒋承建1，赵飞1，2，郭艳3，池菊芳1，郭航远1，2

（1.绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院 心内科，浙江 绍兴 312000；2.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；3.浙江中医药大学 研究生院，浙江 杭州 310000）

目的：探索提高大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）原代培养效率和纯度的方法。方法：在原有组织贴块法培育大鼠原代VSMCs的基础上进行改良，分离出胸主动脉后进一步分离中膜，DMEM高糖培养基中加入10 μg/L血小板源性生长因子B（PDGF-B）。用细胞形态学及细胞免疫荧光对VSMCs进行鉴定。结果：6 d左右组织块周围有细胞爬出，12 d左右可以传代。镜下见细胞呈梭形，典型“峰谷”状排列生长；免疫荧光鉴定可见大量平滑肌肌动蛋白（SMA），比传统方法获得的细胞纯度高。结论：加入PDGF-B可以缩短大鼠VSMCs原代培养时间，提高效率；剥离中膜可以提高大鼠VSMCs原代细胞的纯度。

原代细胞；血管平滑肌细胞；组织贴块法；血小板源性生长因子B

血管成形术和支架植入术是治疗严重冠状动脉粥样硬化的主要方法，术后发生血管再狭窄是心血管医师面临的一个棘手的问题[1]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和迁移以及从已经分化的收缩型表型向未分化的分泌型表型转化造成大量的细胞外基质分泌[2-4]，在术后再狭窄发生过程中发挥了重要的作用。体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌原代细胞，是研究VSMCs增殖迁移以及细胞表型转化的重要基础。目前大鼠胸主动脉VSMCs的培养方法主要包括酶消化法[5]和组织贴块法[6-7]。由于酶消化法成本较高，获得的细胞活性较贴块法差，所以国内一般采用组织贴块法来培养大鼠胸主动脉VSMCs。但组织贴块法获得VSMCs存在周期长、纯度低等缺点。因此，笔者对组织贴块法大鼠主动脉VSMCs原代培养方法进行了部分改良，缩短了培养周期，获得了纯度高、活性好的VSMCs。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠，雌雄不限，50 d左右，体质量150～180 g（购自浙江省医学科学院实验动物中心）。

1.1.2 实验试剂：乙醚（杭州化学试剂有限公司），DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和链霉索（GIBCO公司），抗大鼠平滑肌肌动蛋白（SM-actin，SMA）单克隆抗体（ABCOM公司），异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗兔IgG（Jackson公司），血小板源性生长因子B（platelet derived growth factor，PDGF-B，R&D公司）。

1.1.3 实验仪器和设备：CO2培养箱（Thermo公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），倒置显微镜、荧光显微镜（Nikon公司），低速离心机（合肥科大创新中佳公司），组织剪、止血钳（上海医疗器械集团有限公司手术器械厂），眼科剪、眼科镊（苏州六六视觉科技股份有限公司），显微剪、显微镊（宁波成和显微器械厂），25 cm细胞培养瓶（康宁公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠胸主动脉VSMCs原代培养：用乙醚将大鼠麻醉后，将除大鼠头部以外的部分全部置于75%乙醇浸泡3 min消毒。在无菌动物操作台上，打开大鼠胸腔，翻开肺之后即可见胸主动脉，用眼科镊小心分离胸主动脉，剪下后放入盛有DMEM高糖培养基的培养皿中，转入细胞操作室，在体式显微镜下，用显微镊快速去除血管周围大块的脂肪组织，用显微剪剪开血管，去除血凝块后将剪开的动脉转入另一干净的盛有DMEM高糖培养基的培养皿中。用眼科弯镊轻轻刮除动脉内膜，去除内皮细胞。然后剪开的动脉内膜面朝上，准备两把眼科弯镊，一把按压固定血管，一把压住动脉后往相反方向推，中膜会出现破口，随后中膜和外膜之间由于组织结构的不同而分离开来。刮取下来的中膜因富含VSMCs而保持了血管形态，而外膜在失去中膜的支撑之后失去原有的血管结构。将分离下来的中膜移到培养皿的盖子内面，转入超净工作台。用眼科剪剪碎血管中膜，用长滴管头部黏住剪碎了的组织块，小心转入细胞培养瓶，均匀贴壁，组织块间距大约为5 mm。直立细胞培养瓶，加入5 mL含有20%胎牛血清以及10 μg/L PDGF-B的DMEM高糖培养液，盖紧瓶盖，细胞瓶倒置放于细胞培养箱中约3 h，使组织块牢固贴壁，缓慢翻转培养瓶，使培养液覆盖组织块。静置4～6 d，换液1次，6 d左右可见细胞爬出，10～14 d组织块周围的细胞出现融合，可以消化传代。

1.2.2 大鼠胸主动脉血管平滑肌原代细胞的鉴定：①形态学鉴定：常规倒置相差显微镜下观察VSMCs的形状、排列以及生长特点。②细胞免疫荧光：将第2代细胞接种于96孔板，每孔3 000～5 000个细胞，培养1～2 d待细胞开始融合前，PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，PBS清洗3遍后再用0.25% TritonX 100穿破细胞膜，PBS清洗3遍，山羊血清室温封闭1 h，加入稀释250倍的抗SMA抗体，4 ℃过夜，PBST清洗3遍之后加入结合有FITC的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h后PBS清洗3遍，再用1 μg/mL DAPI染核，PBS清洗。用荧光显微镜拍摄同一界面的绿色荧光图和蓝色核染图，经Image pro plus 6.0将同一部位的两张照片叠加，判断VSMCs纯度。

2 结果

2.1 形态学观察 大鼠胸主动脉VSMCs原代培养时6 d左右组织块周围有细胞爬出，细胞形态多样，呈梭形、星形、卵圆形、不规则型（见图1A）。12 d左右组织块周围的细胞明显融合，可以进行传代（见图1B）。传代之后细胞形态区域一致成梭形条状，并出现典型的“峰谷”现象（见图1C）。

图1 大鼠胸主动脉VSMCs原代培养（×100）

2.2 细胞免疫荧光鉴定 经抗SMA定位细胞肌动蛋白，结合有FICT荧光的二抗在激发显影后可在荧光显微镜下呈现出绿色荧光，细胞核不着色（见图2A）。DAPI染核之后，细胞核在荧光显微镜下呈现出蓝色荧光，细胞质不着色（见图2B）。用Image pro plus 6.0将同一部位的DAPI核染与FICT荧光照片合成之后，可见细胞核和SMA之间的关系。用传统的不剥离主动脉中膜的方法，有些细胞核的周围并没有FICT绿色荧光显影（见图2C），而用本实验中改良了的剥离中膜培养VSMCs的方法获得的VSMCs，基本是核与SMA绿色荧光一一对应（见图2D）。

3 讨论

PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，能够刺激胶原酶的活化和胶原的合成，调节细胞外基质的更新，并促进DNA合成和细胞裂解，最终促进VSMCs分裂增生[8-9]。虽然有国外研究显示铺入细胞瓶中的大鼠主动脉中膜组织块周围也可以检测到有PDGF等生长因子的分泌，但是其浓度很低，而且在组织块周围的浓度分布不均匀[10]。本实验用原先没有加入PDGF-B的原代培养方法，组织块周围一般要8 d左右才有细胞爬出，2周左右细胞开始融合，而用加入10 μg/L PDGF-B的原代培养改良方法，约6 d组织块周围就有细胞爬出，10 d左右出现细胞融合，可以有效缩短原代培养的时间，提高实验效率。

大鼠胸主动脉组织结构分为三层，分别为内膜、中膜和外膜。内膜很薄，主要由内皮细胞构成，由于内皮细胞相对比较脆弱，取出大鼠胸主动脉剪开血管后，用弯镊轻轻刮过内膜，即可将内皮细胞去除；中膜较厚，主要由VSMCs组成，是血管收缩的结构基础；外膜的厚度与中膜相当，主要由疏松结缔组织组成。外膜和中膜之间有外弹性膜相隔。传统的大鼠主动脉血管平滑肌原代培养方法在刮去内膜之后直接剪碎血管铺入培养瓶中，没有将中膜和外膜分离开，造成外膜中成纤维细胞跟中膜中的平滑肌细胞一起培养出来（如图2C所示）。虽然国内有文献报道称这些成纤维细胞在几次传代之后会自然消失，可以通过传代的方法达到纯化平滑肌细胞的目的[11]，但是据Sartore等[12]的研究发现，成纤维细胞在外部环境发生改变时会转变成肌成纤维细胞，跟平滑肌细胞一样可以表达SMA，造成平滑肌细胞鉴定时的假阳性结果。所以在原代细胞培养时，为了获取高纯度的VSMCs，将中膜与外膜分离开是完全有必要的。笔者通过反复实验摸索发现用镊子牵拉、撕扯、分离中膜的方法会大大损伤组织块的活性，以致铺瓶之后的组织块活性降低或者消失，延长原代细胞爬出时间甚至培养失败。结合大鼠胸主动脉结构的组织基础，本实验室在剪开胸主动脉去除血凝块刮去内膜之后，采用两把眼科弯镊，一把按压固定血管，一把向相反方向钝性加压，中膜在出现破口之后开始与外膜分离。用此方法既可以剥离下来完整的保留血管结构的中膜，又大大减少了剥离过程中对中膜的牵拉损伤，最大程度上保护了中膜的活性，提高原代VSMCs的纯度。

另外由于幼年SD大鼠的VSMCs分裂增殖相对活跃，结合幼鼠操作上的难易程度，实验一般选用6周龄左右的SD大鼠。为了更好地保持取出的主动脉血管活性，操作时采用预冷的DMEM高糖培养液。笔者在实验中发现，边缘整齐的组织块相比于边缘粗糙的组织块周围更容易长出VSMCs，可能是因为在剪碎血管中膜时边缘整齐的组织块所受到的破坏较小，所以选用锋利的眼科剪来剪碎血管中膜有利于原代平滑肌细胞的培养。在组织块贴块培养时，组织块周围会分泌一些PDGF、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等有利于原代细胞爬出的细胞生长因子[8]，频繁地移动观看细胞生长情况会降低组织块周围的细胞生长因子浓度，导致原代细胞培养时间延长甚至培养失败，一般4 d左右换液1次即可。

综上所述，在原有用组织块法培养原代大鼠胸主动脉VSMCs的基础上，通过在培养液中加入10 μg/L PDGF-B，可以缩短原代的培养时间，提高效率；通过弯镊加压分离血管中膜，可以提高原代VSMCs的纯度。

[1] Ali ZA, de Jesus Perez V, Yuan K, et al. Oxido-reductive regulation of vascular remodeling by receptor tyrosine kinase ROS1[J]. J Clin Invest, 2014, 124(12): 5159-5174.

[2] Alexander MR, Owens GK. Epigenetic control of smooth muscle cell differentiation and phenotypic switching in vascular development and disease[J]. Annu Rev Physiol, 2012, 74: 13-40.

[3] Martin KA, Merenick BL, Ding M, et al. Rapamycin promotes vascular smooth muscle cell differentiation through insulin receptor substrate-1/phosphatidylinositol 3-kinase/ Akt2 feedback signaling[J]. J Biol Chem, 2007, 282(49): 36112-36120.

[4] Martin KA, Rzucidlo EM, Merenick BL, et al. The mTOR/ p70 S6K1 pathway regulates vascular smooth muscle cell differentiation[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 286(3): C507-517.

[5] Jiang H, Lun Y, Wu X, et al. Association between the hypo

methylation of osteopontin and integrin beta3 promoters and vascular smooth muscle cell differentiation in great saphenous varicose veins[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(10): 18747-18761.

[6] Ailawadi G, Moehle CW, Pei H, et al. Smooth muscle phenotypic modulation is an early event in aortic aneurysms[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2009, 138(6): 1392-1399.

[7] 王生兰, 娟苏, 徐一洲. 大鼠血管平滑肌细胞体外培养的表型转换及其鉴定[J]. 中国动脉硬化杂志, 2008, 16(4): 268-272.

[8] McKinnon RD, Waldron S, Kiel ME. PDGF alpha-receptor signal strength controls an RTK rheostat that integrates phosphoinositol 3’-kinase and phospholipase Cgamma pathways during oligodendrocyte maturation[J]. J Neurosci, 2005, 25(14): 3499-3508.

[9] 许欢, 陈鑫, 邱志兵, 等. 组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定[J]. 医学研究, 2009, 38(11): 64-66.

[10] Barker JC, Barker AD, Bills J, et al. Genome editing of mouse fibroblasts by homologous recombination for sustained secretion of PDGF-B and augmentation of wound healing[J]. Plast Reconstr Surg, 2014, 134(3): 389e-401e.

[11] 周晓莉, 寒雷, 青柳. 血管平滑肌细胞的培养及鉴定[J]. 重庆医学, 2006, 34(5): 877-878.

[12] Sartore S, Chiavegato A, Faggin E, et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant[J]. Circ Res, 2001, 89(12): 1111-1121.

（本文编辑：丁敏娇）

An improvement in primary culture of rat vascular smooth muscle cells and its identification

MENG Liping1,2, JIANG Chengjian1, ZHAO Fei1,2, GUO Yan3, CHI Jufang1, GUO Hangyuan1,2. 1.Department of Cardiology, Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing Hospital of Zhejiang University, Shaoxing, 312000; 2.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310000

Objective: To explore a new effective way on primary culture of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs), which could shorten the cultivate time and enhance the VSMCs’ purity. Methods: The primary culture of rat VSMCs was conducted by a new way reformed from the traditional modified tissue explant technique, in which the medial layer was isolated and 10 μg/L PDGF-B was added to the high glucose DMEM. The VSMCs were identified by cell morphology and immunocytochemistry. Results: About six day later, VSMCs could be found around some tissue blocks, and passage of the VSMCs can be done about 12 days later. Under the phase contrast microscope, the VSMCs looks like spindle and the specific “hill and valley” phenomenon could be seen. Immunocytochemistry showed that there was a large number of smooth muscle actin (SMA) and the VSMCs’ purity was much higher than the cells got by the old way. Conclusion: Adding PDGF-B could shorten the cultivate time of primary VSMCs and isolation of the medial layer could improve the VSMCs’purity.

primary cells; VSMCs; tissue explant technique; PDGF-B

R331

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.011

2014-12-15

浙江省自然科学基金资助项目（LY14H020002）；浙江省卫生高层次创新人才培养工程资助项目（CXRC201201）；浙江省公益技术研究社会发展项目（2012C33040）；绍兴市科技局科研基金资助项目（2013B70072）。

孟立平（1989-），男，浙江绍兴人，硕士生。

郭航远，主任医师，教授，博士生导师，Email：ghangyuan @hotmail.com。