苦楝树皮提取物对斜纹夜蛾的毒杀和拒食作用

葛军军，陈翩，黄依露，冯波，叶晓霞

（温州医科大学，浙江 温州 325035，1.药学院；2.环境与健康生态研究所）

·论 著·

苦楝树皮提取物对斜纹夜蛾的毒杀和拒食作用

葛军军1，陈翩1，黄依露1，冯波2，叶晓霞1

（温州医科大学，浙江 温州 325035，1.药学院；2.环境与健康生态研究所）

目的：观察苦楝树皮提取物中不同极性组段对斜纹夜蛾幼虫的毒杀与拒食作用，寻找活性成分主要存在的组段。方法：苦楝树皮经95%乙醇冷浸提取，浓缩成浸膏，用乙酸乙酯萃取后得到粗提物，运用硅胶柱层析分离为不同极性的15个组段（K1～K15），采用叶碟法测定不同极性组段在低剂量（10-6g/mL）、中剂量（10-4g/mL）、高剂量（10-2g/mL）下对斜纹夜蛾幼虫的取食叶面积与死亡率的影响。结果：苦楝树皮提取物对斜纹夜蛾幼虫具有明显的拒食作用，且与剂量成正比。而K5、K6、K10组段在10-2g/mL浓度下表现出了强烈的毒杀作用，死亡率为100%。K11组段对斜纹夜蛾幼虫也有一定的毒杀作用，死亡率为33.3%。K5、K6组段在10-6g/mL浓度下，均有较好的拒食作用。结论：K5、K6组段比K10、K11组段对斜纹夜蛾幼虫具有更显著的拒食与毒杀作用，且在K5、K6组段中有望分离得到单一活性成分。

苦楝树皮；乙酸乙酯提取物；斜纹夜蛾；拒食活性；毒杀作用

植物源农药以高效、低毒、低残留、无公害等特点而获得了越来越多的关注，尤其是在化学性农药广泛流行的现在，从植物中提取分离对昆虫有防治作用的活性物质显得尤为重要。

苦楝（Melia azedarach Linn.）隶属楝科，为楝科落叶乔木植物，是药用植物[1-6]。《中国药典》中记载，苦楝具有杀虫等药用价值。现代药理学研究表明，其次级代谢产物，尤其是三萜类化合物常表现出昆虫拒食活性[7-8]。但此类研究往往集中于乙醇粗提取物，对苦楝中单一活性化合物的毒杀与拒食活性研究鲜见报道。因此，本研究采用叶碟法，观察苦楝树皮乙酸乙酯提取物及其不同极性组段对斜纹夜蛾幼虫（Spodoptera litura）[9]的拒食作用，以希望找到活性单体主要存在的组段，对其进行分离纯化，为开发天然、绿色的农药奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫：斜纹夜蛾幼虫，龄期为4～6龄，采集自浙江省温州市瓯海区芋田内，置于28 ℃室内用卷心菜菜叶饲养，繁殖2代后，挑选健康、大小一致的幼虫供试。

1.1.2 试剂与仪器：硅胶H及薄层层析硅胶板HSGF254（青岛海洋化工有限公司）；茴香醛显色剂（实验室自配：135 mL无水乙醇+5 mL浓硫酸+1.5 mL冰醋酸+3.7 mL茴香醛）；乙醇、石油醚、乙酸乙酯（无锡市佳妮化工有限公司）；ZF-1型三用紫外分析仪（上海科学仪器有限公司）；R-205型旋转式蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 苦楝树皮乙酸乙酯提取物的提取：取干燥的苦楝树皮样品10.6 kg，粉碎，用95%乙醇冷浸3次，每次冷浸7 d。合并冷浸后的提取液，减压回收乙醇至无醇味，浓缩得到浓浸膏约200 g。将上述得到的浓浸膏用蒸馏水混悬，再用乙酸乙酯萃取数次，减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物160 g，从中取200 mg，溶于50%乙醇中配置成不同浓度的溶液，冷藏备用。

1.2.2 苦楝树皮乙酸乙酯提取物的分离：取苦楝树皮乙酸乙酯提取物145 g，用硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚/乙酸乙酯（20∶1→1∶1）梯度洗脱，薄层层析硅胶板跟踪，合并相似成分，共得到15个不同极性组段（K1～K15）。分别取各组段200 mg，溶于50%乙醇中配置成不同浓度（10-2g/ mL、10-4g/mL、10-6g/mL）的溶液，冷藏备用。鉴于三萜类活性物质为中、小极性化合物，故本研究着重对中、小极性组段（K4～K13）进行活性实验。1.2.3 拒食活性的测定：采用叶碟法[10]，将卷心菜菜叶清洗干净，晾干。用方形打孔器（2.5 mm× 2.5 mm）打成叶碟，放入供试样品的稀释液（50%乙醇稀释）中浸泡5 s，对照组则放入50%乙醇水溶液中浸泡5 s。取出叶碟在阴凉处挥发，待溶剂挥发完全后放入垫有滤纸（加少量蒸馏水保湿）的培养皿（直径9 cm）中。每个培养皿放入1片叶碟，接入已饥饿2 h的试虫1头，每隔2 h后用方格纸分别计算试虫取食叶面积（mm2）。每天重复上述操作3次，其余时间喂食未经处理的菜叶。试虫化蛹时则实验结束。拒食率的计算公式：

1.2.4 毒杀作用的测定：采用浸叶接虫法[11]，将卷心菜菜叶清洗干净，晾干。用方形打孔器（2.5 mm× 2.5 mm）打成叶碟，放入供试样品的稀释液（50%乙醇稀释）中浸泡5 s，对照组则放入50%乙醇水溶液浸泡5 s。取出叶碟在阴凉处挥发，待溶剂挥发完全后放入垫有滤纸（加少量蒸馏水保湿）的培养皿（直径9 cm）中。每个培养皿放入5片叶碟，接入试虫1头（防止饥饿时互相撕咬，影响实验结果），每隔24 h观察试虫死亡数，并更换新鲜处理叶碟。连续记录72 h。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 19.0统计软件进行分析。所有数据均为计量资料，以表示。组间差异比较采用One-way ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦楝树皮乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用 如表1所示，不同浓度的苦楝树皮乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾幼虫有明显的拒食活性，拒食活性的高低与浓度成正比。

表1 苦楝树皮乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n= 18，）

表1 苦楝树皮乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n= 18，）

注：数据右上角不同的字母表示各组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）

组别平均每次取食面积（mm2）平均每次拒食率（%）苦楝树皮10-2g/mL12.15±1.49a66苦楝树皮10-4g/mL18.59±2.32b47苦楝树皮10-6g/mL24.78±3.34c30对照组35.22±4.44d0

2.2 苦楝树皮各组段在不同浓度下对斜纹夜蛾幼虫的毒杀效果 在10-2g/mL浓度下，含有K5、K6、K10组段的叶碟喂食试虫1 h后，试虫开始出现死亡现象，并且死亡率均达到了100%，对试虫表现出了强烈的毒杀作用。含有K11组段的叶碟喂食试虫2 d后，试虫开始出现死亡现象，死亡率为33.3%，而喂食了其他组段的试虫死亡率均为0，无毒杀作用。在10-4g/mL、10-6g/mL浓度下，所有试虫死亡率均为0，无毒杀作用。

2.3 苦楝树皮各组段在不同浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食测定

2.3.1 各组段在10-2g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用：在上述的毒杀实验中，K5、K6、K10组段表现出强烈的毒杀作用，因此，这3组不列入10-2g/mL浓度下拒食活性测定。对无（弱）毒杀作用的组段（K4、K7～K9、K11～K13）进行了拒食活性测定。结果如表2所示，在10-2g/mL浓度下，各组段处理过的叶碟喂食试虫后，试虫均表现出了拒食活性。但K4组段对试虫平均每次的拒食率下降幅度很大，由于本研究着重探寻活性成分主要存在的组段，故K4组段不列入后续研究。

表2 各组段在10-2g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n=18，）

表2 各组段在10-2g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n=18，）

注：数据右上角不同的字母表示各组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），相同的字母表示各组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）

组段虫龄平均每次取食面积（mm2）平均每次拒食率（%）K44 8.16±1.07e81.8 K74 2.56±0.26c94.3 K84 4.47±0.73d90.0 K94 4.38±0.68d90.0 K114 0.34±0.09a99.2 K124 1.27±0.21b97.2 K134 5.01±0.41d88.8对照444.88±4.14f0 k4556.39±3.45e40.9 k75 7.58±1.13c92.1 k85 8.55±1.36c91.0 k95 8.81±1.03c90.8 k115 0.68±0.18a99.3 k125 2.57±0.41b97.3 k135 37.6±1.58d60.6对照595.49±7.01f0 k46211.93±7.57f033.7 k7619.40±2.47b93.9 k8629.16±2.16c90.9 k9629.29±1.64c90.8 k116 0.82±0.43a99.7 k12645.94±3.22d85.6 k13658.92±3.32e81.6对照6319.61±12.08g0

2.3.2 各组段在10-4g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用：如表3所示，在10-4g/mL浓度下，对4龄试虫而言，各组段均有拒食作用。对5龄试虫而言，K8、K9、K11、K12组段无拒食作用，此外K13组段的拒食作用也较弱，其余各组段的拒食作用均较明显。对6龄试虫而言，K9、K12组段无拒食作用，而K8、K11、K13组段的拒食作用也很弱，拒食率均在15%以下，其余各组段的拒食作用均较明显。而K8、K9、K11、K12、K13组段对试虫平均每次的拒食率下降幅度最明显，由于本实验着重探寻活性成分主要存在组段，故接下来K8～K9、K11～K13组段不列入研究对象。

表3 各组段在10-4g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n=18，）

表3 各组段在10-4g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n=18，）

注：数据右上角不同的字母表示各组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），相同的字母表示各组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）

组段虫龄平均每次取食面积（mm2）平均每次拒食率（%）K5409.71±1.33ab70.5 K646.53±1.06a80.2 K7412.14±1.34c0 63.2 K8431.22±1.89e0 5.4 K9421.50±1.84d0 34.8 K1046.24±1.26a81.1 K114 8.24±0.95ab75.0 K12420.19±1.55d038.8 K13411.05±1.10bc66.5对照432.98±5.64e00 K55 21.9±3.93ab68.3 K6513.59±1.42a080.3 K7520.41±1.82b070.4 K8587.80±8.92de-27.2 K95109.23±9.02e0-58.2 K10524.07±2.63b065.1 K11576.61±9.10d0-10.1 K125 97.30±12.96de-40.9 K13549.02±4.30c029.0对照569.04±6.70d00 K5666.17±2.77b079.9 K6647.24±4.88a085.7 K7683.85±4.08c074.6 K86323.93±14.94de1.8 K96371.46±13.84g0-12.6 K10688.76±3.51c073.1 K116286.77±10.30d013.1 K126359.73±11.79fg-9.0 K136314.56±14.66de4.7对照6329.93±14.30ef0

2.3.3 各组段在10-6g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用：如表4所示，在10-6g/mL浓度下，所有组段对各龄期试虫均有拒食作用，尤其是K5、K6组段，平均每次的拒食率下降幅度很少，拒食效果最好。实验表明K5、K6组段为拒食活性成分主要存在的组段，对此两组段进行分离纯化，有望得到单一活性化合物。

表4 各组段在10-6g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n=18，）

表4 各组段在10-6g/mL浓度下对斜纹夜蛾幼虫的拒食作用（n=18，）

注：数据右上角不同的字母表示各组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），相同的字母表示各组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）

组段虫龄平均每次取食面积（mm2）平均每次拒食率（%）k54 13.59±3.34ab60.3 k64 12.25±1.00a64.2 k74 11.39±1.39a66.8 k104 17.99±2.03b47.6对照4 34.30±2.30c0 k55 51.14±1.21a66.2 k65 64.88±0.62b57.1 k75 96.80±1.95c36.0 k105 97.33±1.53c35.7对照5151.27±9.21d0 k56198.66±2.12a42.9 k66207.77±1.39a40.3 k76318.83±2.63b8.4 k106317.35±3.35b8.8对照6347.93±7.10c0

3 讨论

斜纹夜蛾主要以幼虫危害植物全株，是一种危害性很大的害虫。本研究特选择此虫进行拒食活性研究，结果显示，苦楝树皮乙酸乙酯提取物在10-2g/ mL、10-4g/mL、10-6g/mL下对斜纹夜蛾幼虫有明显的拒食活性，且与浓度成正比，证明苦楝树皮中存在拒食活性成分。将苦楝树皮乙酸乙酯提取物进行进一步分离得到不同极性组段（K1～K15）。斜纹夜蛾幼虫的毒杀结果显示，K5、K6、K10组段在10-2g/mL浓度下表现出强烈的毒杀作用，K11组段对斜纹夜蛾幼虫也有一定的毒杀作用，而其在10-4g/mL和10-6g/mL浓度下无毒杀作用。这提示我们在这4个组段中存在单一活性物质，在高浓度下对斜纹夜蛾幼虫有毒杀作用。此外，斜纹夜蛾幼虫的拒食结果显示，K5、K6组段即使在10-6g/mL浓度时，仍有较好的拒食作用，这表示对斜纹夜蛾幼虫有拒食作用的成分主要分布在这两个组段。

在后续研究中，我们对K5、K6组段进行了分离纯化，并得到了14个单一化合物（数据另文发表）。各单一化合物对斜纹夜蛾幼虫的拒食活性尚在研究中。

[1] 李桂英, 支国. 苦楝皮提取物的抗肿瘤活性研究[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(11): 6433-6434.

[2] 叶银英, 何道伟. 苦楝、黄药子抗癌成分的细胞学评价[J].中国生化药物杂志, 1998, 19(4): 187-188.

[3] Guo C, Wang JS, Zhang Y, et al. Relationship of chemical structure to in vitro anti-inflammatory activity of tirucallane triterpenoids from the stem barks of Aphanamixis grandifolia[J]. Chem Pharm Bull, 2012, 60(8): 1003-1010.

[4] 翟兴礼, 王启明, 王立娟. 苦楝果实提取物对几种芽孢菌的抑菌活性[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(9): 1908-1909.

[5] 姜萍, 叶汉龄, 安鑫南. 苦楝提取物的提取及其抑菌活性的研究[J]. 林产化学与工业, 2004, 24(4): 23-27.

[6] 沈雅琴, 张明发, 朱自平, 等. 苦楝皮的镇痛抗炎和抗血栓形成作用[J]. 中国药业, 1998, 13(10): 30-31.

[7] 王文陆, 赵善欢, 韩玖, 等. 苦楝中几种杀虫有效成分对菜青虫和亚洲玉米螟的生物活性[J]. 植物保护学报, 1992, 19(4): 359-364.

[8] 顾静文, 刘立鼎, 肖忆良, 等. 苦楝果实植物杀虫剂的开发研究[J]. 江西科学, 1995, 13(3): 142-148.

[9] Mathews RW, Mathews JR. Insect behavior[M]. Springer Netherlands, 1978: 245-254.

[10] 林启寿. 中草药成分化学[M]. 北京: 科学出版社, 1977: 538-539.

[11] 张宗炳. 杀虫药剂的毒力测定[M]. 北京: 科学出版社, 1988: 433-434.

（本文编辑：吴昔昔）

Antifeeding and toxic activity of ethyl acetate extract from barks of Melia azedarach L against Spodoptera

litura larvaeGE Junjun1, CHEN Pian1, HUANG Yilu1, FENG Bo2, YE Xiaoxia1. 1.School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Institute of Healthy & Environmental Ecology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: In order to find new compounds with strong antifeeding activities, the crude extract and fractions from barks of Melia azedarach L. were selected for their antifeeding and toxic activity against Spodoptera litura larvae. Methods: The 95% ethanol extract of the barks of Melia azedarach L. was concentrated, and the aqueous solution was partitioned with ethyl acetate. The ethyl acetate extract was subjected to silica gel CC eluted with ether-ethyl acetate to give 15 fractions (K1～K15). The fractions were investigated against Spodoptera litura larvae by leaf disc method to test the leaf area and the mortality. Results: Ethyl acetate extract from barks of Melia showed significant antifeeding activity against Spodoptera litura larvae, which was improved with increased dosages. Fractions 5, 6, 10 displayed strong toxic effects, and Fraction 11 also indicated toxic effects. Fractions 5, 6 revealed strong antifeeding activity even at the low concentration. Conclusion: Fractions 5, 6 demonstrate obvious antifeeding and toxic activity against Spodoptera litura larvae than Fractions 10, 11. The fractions which reflect stronger antifeeding activity will be isolated and purifies in hoping of achieving the new active compounds.

Melia azedarach barks; ethyl acetate extract; Spodoptera litura larvae; antifeedant; toxic

R979.8

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.002

2015-05-08

浙江省自然科学基金资助项目（LY12B02007）。

葛军军（1989-），女，浙江湖州人，硕士生。

叶晓霞，教授，硕士生导师，Email：yxx@wmu.edu. cn。