响应面法优化油枣中总黄酮的提取工艺

王争争，杨庆文，杨宇霞，张 磊，赵 欣，李 慧

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

响应面法优化油枣中总黄酮的提取工艺

王争争1，2，杨庆文1，杨宇霞1，张 磊1，赵 欣1，李 慧1

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

在单因素试验的基础上，利用响应面法对影响油枣中总黄酮提取的3个主要因素，乙醇体积分数、料液比、提取温度进行研究，利用Design Expert软件对数据进行回归分析，得到预测模型，并进行验证。结果表明，该方法的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数65%，料液比1∶50（g∶mL），提取温度83℃，在此条件下油枣中总黄酮含量为6.70 mg/g。

油枣；总黄酮；提取工艺；响应面法

红枣（Zizyphu jujube Dates），又名中华大枣、枣、华枣，是鼠李科枣属植物枣树（Zizyphu jujube M ill）的果实。红枣在数千年广泛栽培中，经过不断选择，演化出很多品种，其中油枣色深红、油光发亮，个大、核小、肉厚、含糖高、含脂高，耐储藏，营养价值高，丰产性能好[1-2]，为山西省十大名枣之一。随着近几年人们对红枣功能成分和药理的深入研究，发现红枣中含有一些生物活性成分，如黄酮、多糖、三萜类化合物等[3]。其中黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静镇痛及抗氧化、清除自由基、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等诸多功效，已列为保健食品的一类功能因子[4-6]，因此对枣中的总黄酮进行提取研究具有很好的应用价值[7-9]。

响应面分析（response surface methodology，RSM）是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过分析回归方程来求得最佳工艺参数[10]，是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法[11]。它与正交试验设计法相比，具有试验周期短，得到的回归方程精度高，可以研究多种因素间交互作用等优点[11-12]。

基于上述优点，本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法对油枣中总黄酮的提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺条件，为油枣的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油枣：产于山西省保德县，烘干研磨，过60目筛，密封，置阴凉干燥处备用。

芦丁对照品：中国药品生物制品检定所；无水乙醇（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；亚硝酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：北京化工厂；硝酸铝（分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

UV-1601紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的建立

精密称取干燥至质量恒定的芦丁标准品10 mg，加体积分数为60%乙醇定容至25 m L，得质量浓度为0.4 mg/m L芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L于10 m L比色管中，加入5%的亚硝酸钠0.3m L，摇匀后放置6min，加入10%的硝酸铝溶液0.3m L，摇匀后放置10 m in，加入4%的氢氧化钠4 m L，用体积分数为60%乙醇定容，混匀后放置10 m in，于510 nm波长处测定吸光度值，参比为空白试剂[13]。

1.3.2 油枣中总黄酮的提取及含量测定

试验采用乙醇回流热提取法[12]对枣中的总黄酮进行提取。准确称取0.5 g枣粉，定量加入一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下浸提一定时间，离心后定容至50 m L，得待测样品溶液。准确吸取上述待测液2 m L于10 m L比色管中按照1.3.1中方法进行比色，并用如下公式计算总黄酮含量。

式中：C为依据标准曲线查得被测液中总黄酮的质量浓度，mg/m L；V1为试样处理后总定容体积，m L；V2为测定时样液定容体积，m L；V3为测定用样液体积，m L；m为称取油枣粉的质量，g。

1.3.3 单因素试验

（1）乙醇体积分数

准确称取0.5g枣粉6份，分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液25m L，于80℃水浴上回流提取60 min，离心后定容至50 m L，测定不同乙醇体积分数提取的样品中的总黄酮含量。

（2）料液比

准确称取0.5 g枣粉6份，分别加入5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L、30 m L的体积分数为60%乙醇溶液，于80℃水浴上回流提取60 min，离心后定容至50 m L，测定不同料液比下所提取的样品中的总黄酮含量。

（3）提取时间

准确称取0.5 g枣粉6份，加入体积分数为60%的乙醇溶液25 m L，于80℃水浴上分别回流提取30 m in、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，离心后定容至50 m L，测定不同提取时间所提取的样品中的总黄酮含量。

（4）提取温度

准确称取0.5 g枣粉6份，加入体积分数为60%的乙醇溶液25 m L，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴上回流提取60 min，离心后定容至50 m L，测定不同温度下提取的样品中的总黄酮含量。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，采用Design-Expert 8.0软件中Box-Behnken试验设计原理，选择影响总黄酮提取量的3个主要因素：乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C），以总黄酮提取量（Y）为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验，因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 验证性试验

通过Design-Expert8.0软件分析，对二次多项回归方程模型得出的最佳条件进行验证性实验。

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

按照1.3.1配制芦丁标准溶液系列，以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。由图1可知，标准曲线回归方程为y=12.493x-0.002 9，相关系数R2=0.999 7，表明二者线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 乙醇体积分数对油枣中总黄酮提取量的影响

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effects of ethanol content on total flavonoids extraction

由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，油枣中总黄酮提取量先升高后下降，当乙醇体积分数达60%时，其总黄酮提取量达最大值6.422 mg/g，当乙醇体积分数再增加时，其总黄酮提取量下降，可能是由于总黄酮类化合物随着乙醇含量增加，其溶解度降低，同时一些醇溶性物质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些物质同总黄酮类化合物竞争同乙醇和水分子的结合，从而导致总黄酮提取量的下降[15]。因此，乙醇体积分数60%为宜。

图3 不同料液比对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effects of sdid-liquid ratio on total flavonoids extraction

2.3 料液比对油枣中总黄酮提取量的影响由图3可知，随着料液比的增大，油枣中总黄酮提取量的含量先增加后缓慢降低，当料液比为1∶50（g∶m L）时总黄酮提取量达最大值6.460 mg/g。这是因为提取剂较少时，黄酮溶出量不够，而当扩散达到平衡时，提取剂量不会促进黄酮的提取，反而把其他物质溶出，在分离去除这些物质时可能带走了少量黄酮所致。因此，料液比1∶50（g∶m L）较为适宜。

2.4 提取时间对油枣中总黄酮提取量的影响

图4 不同提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.4 Effects of extraction time on total flavonoids extraction

由图4可知，随着提取时间的增加，总黄酮的提取量呈增加趋势，虽然在180 min时总黄酮提取量达到最大值6.460 mg/g，但在120 m in时总黄酮的提取量就达到了6.346 mg/g，从提取工艺的时间、周期、节约能源等角度考虑，提取时间120 min较为适宜。

2.5 提取温度对油枣中总黄酮提取量的影响

由图5可知，随着提取温度的升高，总黄酮的提取量先升高后趋于平缓，在80℃时总黄酮提取量达到一个最大值6.384 mg/g，90℃时略有降低。这是由于温度的升高加速黄酮类物质的渗透、扩散、溶解速度等，使之更容易被提取出来，但过高的温度会使黄酮类化合物氧化[10]。因此，提取温度80℃为宜。

图5 不同提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.5 Effects of extraction temperature on total flavonoids extraction

2.6 响应面试验结果与分析

2.6.1 总黄酮提取响应面试验方案及结果

在单因素试验基础上，固定提取时间为120min，以总黄酮提取量（Y）为响应值，对油枣中总黄酮提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见表2。运用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行方差分析，结果见表3。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

以油枣中总黄酮含量（Y）为响应值，经回归拟合后，各试验因子对响应值的影响可用如下二元回归方程表示：

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

该模型的决定系数R2=0.966 6，表示有96.66%的数据可用该模型解释，说明方程可靠性较高。变异系数（coefficient of variation，CV）值越低说明试验稳定性越好，本试验的CV值为2.39%，说明试验稳定性好，试验操作可信。

由表3的方差分析结果看，模型的P值＜0.01（极显著），表明模型充分拟合试验数据，该方程是油枣中总黄酮含量与提取工艺参数的合适数学模型，能较好地起到预测作用。失拟项P值为0.112 9＞0.1（不显著），表明试验的误差较小，未知因素对试验干扰很少。P值越小说明对总黄酮含量影响越大，所以影响油枣中总黄酮含量的因素按影响大小排序依次为C（提取温度）＞A（乙醇体积分数）＞B（料液比）。

2.6.2 响应面交互作用分析

通过Design-Expert 8.0软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线图和等高线图，结果见图6。

图6 乙醇体积分数、料液比和提取温度的交互作用对总黄酮提取量的响应曲面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ethanol concentration,liquid-solid ratio and extraction temperature on total flavonoids content

由图6可知，随着乙醇体积分数和料液比的增加，总黄酮提取量均先增加后降低，说明乙醇体积分数和料液比过高或过低都不能使总黄酮提取量达最大值，只有它们取到适中值时，才可能最大限度地提取油枣中的总黄酮。从等高线图上看，几乎呈圆形，表明乙醇体积分数与料液比交互作用不明显，且圆形封闭，说明同时存在最大值。

总黄酮含量与乙醇体积分数呈明显的二次抛物线关系，在60%左右出现峰值。根据相似相溶原理，油枣中总黄酮极性与此范围的乙醇极性相当，因此在这一体积分数溶液中溶解性较好；总黄酮含量随提取温度增加显著增加，但达到一定稳定后略有下降。从等高线图上看，呈的椭圆形，表明乙醇体积分数与提取温度交互作用较明显，且椭圆形封闭，说明同时存在最大值。

总黄酮含量与料液比也呈明显的二次抛物线关系，在料液比1∶50（g∶m L）左右出现峰值。从等高线图上看，呈的椭圆形，表明料液比与提取温度交互作用较明显，且椭圆形封闭，说明同时存在最大值。

图6可直观地反映各因素交互作用对总黄酮得率和总黄酮含量的影响。图中曲线越陡峭，表明该因子对油枣中总黄酮提取量的影响越大；反之，曲线越平滑，表明该因子对油枣中总黄酮提取量的影响较小。根据以上的数据分析表明油枣中总黄酮含量的交互影响顺序为：AC＞BC＞AB。

2.7 油枣中总黄酮提取工艺条件的优化

经Design-Expert8.0软件优化，油枣总黄酮最佳提取工艺条件为乙醇体积分数64.69%，料液比1∶50.33（g∶m L），提取温度83.46℃，此时总黄酮提取量理论值达6.681 65 mg/g。考虑到实际操作的可行性，将提取工艺条件修正为乙醇体积分数65%，料液比1∶50（g∶m L），提取温度83℃。为验证结果的可靠性，采用上述优化出的工艺参数进行3次平行试验，得到油枣中总黄酮的实际提取量为6.70 mg/g，与理论预测值接近，表明建立的数学模型对油枣中总黄酮的提取具有实用价值。

3 结论

响应面分析法得到的油枣中总黄酮提取工艺条件为乙醇体积分数65%，料液比1∶50（g∶m L），提取温度83℃。经过验证试验后，得到油枣中总黄酮的实际提取量为6.70 mg/g，与理论预测值接近，表明响应面法可以很好地对油枣中总黄酮提取工艺进行优化。

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Optimization of total flavonoids extraction process from Chinese jujube by response surface methodology

WANG Zhengzheng1,2,YANG Qingwen1,YANG Yuxia1,ZHANG Lei1,ZHAO Xin1,LI Hui1
(1.Shanxi Institute of Bio logy,Taiyuan 030006,China;2.College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

On the basis of single factor tests,the factors of ethanol concentration,solid-liquid ratio and extraction temperature that affect total flavonoid extraction from Chinese jujube were studied by response surface methodology and the model was forecasted and analyzed with Design Expert software.The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows:ethanol content 65%,solid-liquid ratio 1∶50(g∶m l), extraction temperature 83℃.Under this condition,the content of total flavonoids was 6.70 mg/g in Chinese jujube.

Chinese jujube;total flavonoids;extraction technology;response surface methodology

TS255.3

A

0254-5071（2015）03-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.021

2015-02-06

山西科技攻关项目（20110311012-6）

王争争（1982-），女，助理研究员，博士研究生，研究方向为食品加工与安全。