一株耐酒精纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及其特性研究

黄 河，林元山，周 熠，饶力群，卢向阳

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128）

一株耐酒精纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及其特性研究

黄 河，林元山，周 熠，饶力群，卢向阳*

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128）

利用乙醇-CMC-Na平板初筛，经摇瓶发酵复筛，从谷酒成熟酒醪中筛选获得1株耐酒精纤维素酶活力较高的细菌Lys-1249。经生理生化测定、形态观察及16S rDNA基因序列的同源性分析，将其鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。经正交试验优化该菌株的产酶条件，表明该菌株在麸皮2.0%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，培养基初始pH值为7.0，培养温度37℃，发酵周期48 h的条件下，其耐酒精纤维素酶活力达到158.54 U/mL。该菌株在6.0%vol乙醇培养基中生长良好，活性可保持65.95%。

纤维素酶；筛选；鉴定；酒精；发酵

纤维素是由类似于多个葡萄糖分子组成的大分子多糖，为植物细胞壁的主要成分，属于地球上最丰富的可再生资源[1]。纤维素酶是指能降解纤维素β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的生产菌株有细菌、放线菌和丝状真菌[2]。研究较多的是木霉属的酸性纤维素酶，如绿色木霉的纤维素酶，因其纤维素酶酶系完全，活性较高，已成为目前主要的商业化纤维素酶[2]。近年来，纤维素酶、半纤维素酶的产量增加迅速，广泛用于纺织、食品、饮料、酿酒、造纸工业以及医疗行业[3-4]。目前由于化石燃料的逐年减少，国内外学者着力于探索纤维质生产燃料酒精这一新途径；该方法有两步法和共发酵法[5]。但研究结果与淀粉质原料生产酒精的水平相差较大，菌株纤维素酶活力较低、耐酒精度低或耐酸耐碱的能力弱等原因使其难以实现纤维素工业化处理[6]。本试验对耐酒精纤维素酶及其产生菌作了探索，为纤维素原料直接通过共同发酵法生产酒精提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

筛选土壤样品采集来源于从岳麓山、长沙县榔梨镇谷酒坊成熟酒醪等地。

羧甲基纤维素钠盐（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）、氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；刚果红：中国远航试剂厂；硫酸铵（分析纯）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：西陇化工股份有限公司；麸皮、黄豆粉、空谷壳等原料购于当地市场。

筛选培养基：无水乙醇10.0%（灭菌冷却后加入），CMC-Na 1.0%，（NH4）2SO41.0%，KNO30.5%，Na2CO30.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，琼脂2.0%，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

斜面及计数培养基：蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，麸皮（40目）0.5%，琼脂2.0%，pH 7.0，121℃灭菌20 m in。

发酵培养基：麸皮2.0%，蛋白胨0.5%，CMC-Na 0.5% pH 7.0，121℃灭菌20 min。

酒精耐受液体培养基：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%，pH 7.0，121℃灭菌20 m in。冷却后再加入无水乙醇至相应的含量（0～10.0%vol）。

1.2 仪器与设备

M J-106C霉菌培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-60数显恒温搅拌循环水箱：常州市华普达教学仪器有限公司；QYC2112立式恒温摇床：上海福玛实验设备有限公司；V-5000型可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；TOMY ES-315高压蒸汽灭菌锅、KF-3102电子天平：浙江凯丰集团有限公司；ZWL-08B台式低速离心机：常州市华普达教学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的筛选

筛选培养基经灭菌冷却至约60℃时，加入体积分数为10.0%的无水乙醇，混匀迅速倒平板。所取菌株材料按10倍稀释法稀释，取适当稀释度的菌悬液涂布于筛选培养基平板，37℃恒温培养2～3 d。待单菌落长出，用5.0 m L 0.5%无菌刚果红染色浸泡筛选平板10 min，然后倾弃染色液，再用5.0 m L 1.0 mol/L的无菌NaCl洗涤脱色10～20 min，期间更换洗涤脱色液2～3次，观察并测量菌落和水解圈直径大小，选取水解圈和菌落比值较大菌落接种斜面，编号，置于4.0℃冰箱保存备用。

1.3.2 菌株的摇瓶发酵复筛

将初筛菌株接种于250 m L三角瓶（培养基100 m L），200 r/m in、37℃培养48 h，发酵液用4层纱布过滤，滤液在10 000×g条件下离心20 m in，上清即为粗酶液，用于酶活力测定。纤维素酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[7-8]，并作适当修改：取适当稀释初酶液0.5 m L，加入乙醇5.0%vol-CMC-Na 1.0%的底物溶液1.5 m L，对照管酶液预先在100℃条件下煮沸10 m in灭酶活，在50℃水浴中反应30 min。再加入2.0 m L DNS试剂，煮沸5 min，迅速冷却至室温，定容至20 m L，于波长540 nm处测光吸收值。以每分钟由CMC-Na产生1.0 μg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量定义为一个活力单位（U/m L）。

1.3.3 菌株的摇瓶发酵条件优化

根据摇瓶单因素发酵试验结果，选取麸皮、蛋白胨、温度、pH值4个因素，进行4因素3水平L9（34）正交试验。

1.3.4 菌株形态、培养和生理生化鉴定

菌株的形态、培养和生理生化特征的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]、《伯杰细菌鉴定手册》第八版[10]进行。

1.3.5 菌株16S rDNA鉴定及分析

菌种委托北京三博远志生物科技公司进行测序，测序结果通过BLAST与GenBank中的序列进行比对，构建出系统发育树及鉴定。

1.3.6 菌株及菌株分泌纤维素酶耐酒精性能分析

将摇瓶发酵复筛纤维素酶活力较高的菌株，接种于酒精耐受液体培养基中，37℃培养48 h，然后进行平板计活菌。配制不同酒精含量的CMC-Na 1.0%的底物，按耐酒精纤维素酶活力的测定方法，测定纤维素酶在不同酒精含量时的保持率。

2 结果与分析

2.1 耐酒精纤维素酶产生菌平板初筛

在乙醇5.0%-CMC-Na1.0%平板上能够生长且出现水解圈菌落，测量其水解圈和菌落的直径，计算水解圈和菌落的直径比，部分菌株（编号Lys-1214、1209、1467、1468）结果见图1。由图1可知，在乙醇-CMC-Na平板长出的单菌落较多，共获得单菌落1 000多株，随着酒精体积分数的增加，水解圈和菌落的直径均有所减小，但二者的比例变化不大。可见，酒精含量对纤维素酶产生菌的生长和酶的分泌或者酶活性产生阻遏或抑制作用。由于液态的酒精在固体平板中容易挥发，实际的酒精含量要低些。

图1 乙醇-CMC-Na刚果红平板初筛纤维素酶产生菌Fig.1 Screening of cellulose-producing strain on ethanol-CMC-Na plate colored by Congo red

2.2 菌株的摇瓶发酵复筛

根据初筛的结果，选择水解圈和菌落的直径之比＞4的菌株50余株进行摇瓶发酵复筛。结果表明，菌株Lys-1249具有较高的酶活力，菌株Lys-1249在培养基配方为麸皮2.0%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，培养基初始pH 6.0，培养温度37℃，发酵周期48 h的条件下，纤维素酶活力达到123.35 U/m L。

2.3 正交试验优化菌株Lys-1249产酶条件

根据单因素发酵结果，选取麸皮、蛋白胨、温度、pH值进行L9（34）正交试验，结果见表1。从表1可以看出，通过9组发酵条件组合进行试验，酶活力得到较大提高，最高达到132.10 U/m L；从R值的大小RA＞RC＞RB＞RD可以看出，影响因素由强到弱依次为麸皮、温度、蛋白胨、pH值；从K值分析可得出最佳发酵条件组合为A2B2C3D2，即麸皮2.0%，蛋白胨0.6%，温度37℃、pH 7.0。经验证，在麸皮2.0%，蛋白胨0.6%，温度37℃、pH 7.0条件下接种菌株Lys-1249产纤维素酶，耐酒精纤维素酶活力达158.54 U/m L，与学者[11]从酒糟中分离细菌固体发酵纤维素酶活力（261.7 U/g）处于同一水平，但后者未揭示其酒精耐受性能。

表1 发酵条件优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2.4 菌株Lys-1249形态和生理生化特征

通过形态观察及生理生化试验，菌株Lys-1249营养细胞为杆状，杆端钝圆，菌落呈细皱状，在液体培养基表面形成银白色的菌膜，能够液化明胶，还原硝酸盐，不产生H2S，水解淀粉，葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，28～39℃生长良好，芽孢椭圆或柱形，芽孢常见中生，革兰氏染色呈阳性，与芽孢杆菌属（Bacillus）中的枯草芽孢杆菌相似。

2.5 菌株Lys-1249的16S rDNA鉴定及分析

菌株Lys-1249的16S rDNA经测序，序列已提交Gen-Bank数据库，登录号为KM 924828，并通过BLAST与Gen-Bank数据库中已知的细菌序列进行检索比对，构建出系统发育树，结果见图2。从图2可以看出，菌株Lys-1249枯草芽孢杆菌亲缘最近，结合形态分析，该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

图2 菌株Lys-1249的系统发育树Fig.2 Phy logene tic tree of stra in Lys-1249

2.6 菌株Lys-1249耐酒精性能及菌株Lys-1249分泌纤维素酶耐酒精性能分析

将菌株Lys-1249接种于含有不同酒精度的液体培养基中，37℃培养48 h，用平板涂布法计活菌数（配方同斜面培养基），结果见图3。从图3可以看出，随着培养基酒精的增加，培养基中活菌数逐渐减少。菌株Lys-1249耐受酒精的程度与张灵等[12]报道的纤维素分解菌链霉菌-13大约相当，不过链霉菌-13所产的纤维素酶耐受酒精程度，未见后续报道。

配制酒精含量（0～10.0%）-CMC-Na 1.0%的底物，按纤维素酶活力的测定方法，测定菌株Lys-1249纤维素酶对不同酒精度的保持率，结果见图4。从图4可以看出，随着底物中酒精度的增加，菌株Lys-1249纤维素酶活性逐渐下降，当酒精度为6.0%vol，可保持原有纤维素酶65.95%活性；酒精度为10.0%vol，纤维素酶活性仅剩余10.01%。与学者[13]通过诱变获得黑曲霉获得天然纤维素降解菌株Aspergillus niger sp.CA-10所产纤维素酶的耐酒精性能（10%vol）处于同一水平，但Lys-1249所保留的纤维素酶活较高。

图4 酒精含量对菌株Lys-1249纤维素酶活性的影响Fig.4 Effects of ethanol content on strain Lys-1249 cellulase activities

3 结论

国家发改委就我国生物燃料产业发展作出阶段性的统筹安排，预计到2020年，我国生物燃料消费量将占到全部交通燃料的15%左右，建立起具有国际竞争力的生物燃料产业[14]。本研究以羧甲基纤维素钠为单一碳源，培养基中通过添加乙醇，施加环境选择压力，获得1 000多株耐不同程度酒精纤维素酶产生菌。尽管平板固体培养基中酒精在培养过程中有所挥发，但从结果看来，随着酒精度的增加，纤维素酶产生菌的水解圈和菌落直径菌有所减少，酒精对细菌生长及其纤维素酶活性影响很大，从研究结果可以判断，该方法用于初筛耐酒精菌株及其纤维素酶是比较可靠的，国内外报道鲜见。

枯草芽孢杆菌Lys-1249不仅菌株本身能耐受较高浓度的酒精度，其纤维素酶（纤维素内切酶）也能耐受6.0%vol的酒精，其活力保持近65%，二者具有一致性。结果表明，产耐酒精纤维素酶酶活力最高的单因素条件为：培养基麸皮含量2.0%，蛋白胨含量0.6%，培养基初始pH值为7.0，发酵温度37℃，发酵周期48 h。通过正交试验得到各因素对酶活力的影响强弱为A＞C＞B＞D，说明因素A即培养基麸皮含量对产酶影响最大，因素D即培养基起始pH值对酶活影响最小，正交试验的最佳组合为A2B2C3D2。在此最佳条件下产酶活力为158.54 U/m L，验证了正交优化的结果是Lys-1249产纤维素酶的最佳条件。

本研究通过改良纤维素内切酶测定方法，即在1.0% CMC-Na底物中添加5.0%vol的酒精，初步探索了耐酒精纤维素酶研究方法，为后续研究提供参考。枯草芽孢杆菌Lys-1249是一株原始野生菌，其纤维素酶主要是内切酶（试验数据未列出），其水解纤维素的能力与商品化的木霉纤维素酶相比，是有较大差距的，但有望进一步通过诱变[15]或基因改良，获得产酶能力更高的突变株或基因工程菌，显示该菌具有一定的应用前景。

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Screening,identification of an alcohol-tolerance cellulase-producing strain and its characteristics

HUANG He,LIN Yuanshan,ZHOU Yi,RAO Liqun,LU Xiangyang*
(College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

An ethanol-tolerant strain Lys-1249 with cellulase activity was screened from the mature fermented grain mash by ethanol-CMC-Na plate preliminary screening and shake flask fermentation affination.Strain Lys-1249 was identified as Bacillus subtilis according to morphological observation,physiological and biochemical determination and 16S rDNA sequence analysis.The cellulose-producing condition was optimized by orthogonal experiment,and results showed that the ethanol-tolerant cellulase activity reached 158.54 U/m l when strain Lys-1249 was cultured in the condition of wheat bran 2.0%,peptone 0.6%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO47H2O 0.02%,MnSO40.01%,initial pH 7.0,temperature 37℃and time 48 h.The strain also grew well in medium with 6.0%vol ethanol,and the cellulase activity can keep at 69.95%.

cellulase;screening;identification;alcohol;fermentation

Q 93-331

A

0254-5071（2015）03-0062-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.014

2015-01-06

湖南省科技计划博士后专项资金（2012RS4042）；湖南省研究生科创资金（CXS20113B298）

黄河（1990-），男，硕士研究生，主要从事微生物发酵的相关研究工作。

*通讯作者：卢向阳（1962-），男，教授，博士，研究方向为农业副产品综合利用，作物生理生化研究。