浦东白猪Nramp1基因第6内含子独特突变位点分析

周文兵，张 艳，俞向前，叶承荣，张 峻，朱建国

(1.上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240；2.上海市浦东新区动物疫病预防控制中心，上海 201299;3.闵行区动物疫病预防控制中心,上海 201109）

浦东白猪Nramp1基因第6内含子独特突变位点分析

周文兵1，张 艳1，俞向前2，叶承荣2，张 峻3，朱建国2

(1.上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240；2.上海市浦东新区动物疫病预防控制中心，上海 201299;3.闵行区动物疫病预防控制中心,上海 201109）

Nramp1是学术界近年研究的猪重要抗病基因之一，其第6内含子作为Nramp1的分型重点片段，国内外的诸多猪种均有清晰的测序分析结果。本研究通过提取浦东白猪血液组织DNA，使用PCR技术分离和克隆Nramp1基因的第6内含子基因片段，测序后与以往文献中的其他猪种进行比较。 结果发现，浦东白猪在该段基因中有3个特异的突变点普遍存在，分别是259 bp的A→G突变，331 bp的G→A突变和29 bp后1～2个T碱基的插入。这些突变的发现可以为浦东白猪的育种和Nramp1的抗病性研究提供遗传数据。

浦东白猪；Nramp1基因；第6内含子；PCR；基因突变

浦东白猪作为上海市特有的地方猪种，具有繁殖率高，性成熟早，阉割后，安静少动，适合圈饲，肉质鲜美等特点[1]，是我国宝贵的地方猪种资源中独具特色的一个品种。随着我国养猪业的快速发展，为了防治传染性疾病所导致的药物残留问题日益严重。这个问题既影响人们群众的健康也增加了生产成本。养殖不同品种具有特异性抗病能力的猪种可以有效地降低传染病在不同猪群间的传播能力，最终将会降低猪的养殖成本和提高猪肉产品的质量。Nramp(natural resistance associated macrophage protein)基因即天然抗性相关巨噬蛋白基因家族。该家族基因的初次发现是在20世纪70年代，Bradley[2]等人在小鼠上发现了一个导致杜氏利什曼虫（Leishmania donovani）易感性的等位基因，被命名为Lsh。后来其他科学家[3-4]又先后在小鼠身上找到了对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）易感的等位基因，分别被命名为Ity和Bcg。接着在1982年，这3个等位基因被开始证明在1号染色体上的同一位点[5-6]。借助基因技术的发展，在20世纪90年代Nramp最终被发现和命名[7]后，Lsh/Ity/Bcg均被归入该家族。Nramp1基因也于次年第1个被完整克隆并定位[8]。Nramp1基因在网状内皮细胞器官的巨噬细胞（血液外周白细胞、脾脏、肺等）中表达，和动物体对多种胞内病原微生物的抵抗力相关[9]。由于Nramp1基因较为保守，成为近年受研究较为普遍的抗病基因之一。猪的Nramp1基因，已经在国内的诸多猪种上得到研究，而且研究的方向主要集中在第6内含子的Nde I位点分型，国内地方猪种中仅有贵州的香猪、糯谷猪和宗地花猪[10]以及黑龙江的民猪[11]被进行过Nramp1基因第6内含子的基因测序研究。

本研究采用PCR扩增片段后基因测序的研究方法，对浦东白猪的Nramp1基因第6内含子的核苷酸序列进行研究分析，寻找在该片段浦东白猪相对其他猪种的遗传特异性。本研究的结果将为未来浦东白猪抵抗胞内病原微生物的能力研究提供遗传学理论基础，对Nramp1基因的抗病能力研究也会产生积极的意义。

1  材料和方法

1.1 实验材料

实验中采用从上海浦汇浦东白猪繁育有限公司猪场采集的浦东白猪血液样本，使用购自北京百泰克生物技术有限公司的全血基因组DNA快速提取试剂盒（溶液型），货号：DP1101，提取DNA样本，用DNA溶解液水化后保存于-20 ℃。

1.2 引物和试剂

参照文献[12]中的引物设计，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物设计如下：

F： 5’ GCCAGCTTCCACAGTCT CCAG 3’

R： 5’ GGGGGTACAAAGGGGAA GAAG 3’

引物用去离子水配置成100µM的贮存液，预期扩增片段为483 bp。

1.3 全血基因组DNA快速提取

参照试剂盒说明书进行，简述如下：

1）将血液加入红细胞裂解液中，使血液中的红细胞完全裂解；

2）离心得到白细胞团，利用细胞核裂解液释放出白细胞的基因组DNA；

3）加入蛋白质沉淀液，离心去除蛋白质杂质；

4）异丙醇沉淀DNA；

5）用70%乙醇漂洗数次；

6）晾干后加入DNA溶解液水化。

1.4 PCR扩增和克隆测序

PCR反应总体系25 µl，组分为：Mix，12.5 µl； Dna模板，3 µl；上下游引物，各1 µl；去离子水，7.5 µl。

PCR运行程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 S，64 ℃ 45 S，72 ℃45 S，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

PCR产物用1%的琼脂凝胶电泳检测，目的条带纯化回收，将回收的产物经E.coliDH5α Competent细胞质粒转化后送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。PCR产物电泳，纯化回收和质粒转化中的主要试剂均购自Takara公司。

2  结果

2.1 PCR扩增

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增出的产物均为483 bp左右，与预期片段相符。

图1 浦东白猪Nramp1基因第6内含子PCR扩增产物

2.2 扩增结果片段基因测序

选取10个条带清晰的目的条带片段，从琼脂凝胶中回收，经质粒转化后进行全序列基因测序。基因测序的结果与Gen Bank Nramp1（登陆号：AY368473）的基因序列进行比对，结果发现3个与 AY368473 不同的突变点。突变结果剪辑如图2、3、4所示，其中AY368473.1为从Genbank选取的基因序列，1-10为选取的PCR扩增产物基因序列。浦东白猪的Nramp1基因第6内含子在331位点出现G→A突变；在259位点出现A→G突变；29位点之后插入了1～2个T碱基。

图2 Nramp1第6内含子基因序列比较结果1

图3 Nramp1第6内含子基因序列比较结果2

图4 Nramp1第6内含子基因序列比较结果3

2  讨论

近年国内外猪种的Nramp1基因多态性的研究大多集中在第6内含子，尤其围绕在111 bp位点的C→A突变。自吴宏梅等[12]首次发现该突变在大白猪和松辽黑猪2个猪种上有相反的抗病能力表现后，杨军等[13]、赵生国等[14]以及刘艳冬[10]分别在不同的中外猪种发现了该突变，并证实了该突变可导致抗病力的差异表现。Nramp1基因作为抗病基因，的确具有重要的研究价值。可惜该突变位点发生作用的机理，至今尚未有较为确切的合理解释。我国具有广大的地域，地理上的分割促使了很多地方猪种的独立培育。对这些地方猪种的第6内含子基因序列进行更广泛的基因学研究，或许可以找到更多的可致Nramp1基因抗病性改变的基因突变，这将有助于对该现象的解释，也将对Nramp1基因的抗病机理研究颇有裨益。

本实验采用PCR方法分离和克隆浦东白猪的Nramp1基因第6内含子片段，在采用基因测序方法来检测完该片段后，寻找浦东白猪在该片段中特有的突变位点。结果显示浦东白猪的该片段与国内外已经得到研究的诸多猪种相比具有很高的品种特异性。研究中发现的3个突变位点，既不同于迄今唯一被发现可以产生抗病力差异的111 bp位点突变，与罗文华[15]从4种中外猪种发现的5个突变位点和李娟娟[16]等人从合作猪发现的10个突变位点也没有重复。这个结果说明了浦东白猪在Nramp1抗病基因的遗传独特性，浦东白猪在抗病基因的研究中将可能具有非常重要的作用。如果未来对浦东白猪继续进行相关基因抗病性的基因学和免疫学研究，会对抗病猪种的培育产生难以预料的帮助。

近20年来随着国外猪种的大量引入，国内地方猪种的分布范围严重减小，种群数量急剧下降，部分种群中一些低频率的基因突变位点可能因此而丧失。特别在一些群体基数异常小的猪群，该现象会更加突出。这一方面将使很多地方猪种的遗传特异性更加突出，另一方面也可能会导致该猪种群体中特有的部分遗传特性永远丧失，成为遗传资源的重大损失。利用基因技术对现存地方猪种进行广泛的抗病基因学研究，将能够为保护地方猪种遗传资源产生重要的作用。

[1] 朱鸿伯.川沙县志[M].上海：上海人民出版社，1990：199.

[2] Bradley D J. Letter：Genetic control of natural resistance to Leishmania donovani[J]. Nature，1974，250(464)：353-354.

[3] Plant J， Glynn A A. Genetics of resistance to infection with Salmonella typhimurium in mice[J]. J Infect Dis，1976 ，133(1)：72-78.

[4] P Gros， E Skamene， A Forget. Genetic control of natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG) in mice. The Journal of ImmunologyDecember 1， 1981，127(6)： 2417-2421.

[5] Plant JE， Blackwell J M.O’Brien AD， Bradley DJ and Glynn AA (1982) Are the Lsh and Ity disease resistance genes at one locus on mouse chromosome 1？[J]. Nature (Lond)， 297：510-511.

[6] Skamene E， Gros P， Forget A， et al. Charles C and Taylor BA (1982) Genetic regulation of resistance to intracellular pathogens[J]. Nature (Lond) ，297：506-510.

[7] Vidal S M， Malo D， Vogan K. Skamene E and Gros P (1993) Natural resistance to infection with intracellular parasites： Isolation of a candidate for Bcg[J].Cell，73：469-485.

[8] Cellier M， Govoni G， Vidal S，et al. Schurr E and Gros P (1994) Human natural resistance-associated macrophage protein： cDNA cloning，chromosomal mapping， genomic organization， and tissue-specific expression. J Exp Med 180：1741-1752.

[9] Jenefer M，Blackwell. Structure and function of the natural-resistanceassociated macrophage protein (Nramp1)， a candidate protein for infectious and autoimmune disease susceptibility. Molecular Medicine Today Volume 2， Issue 5， May 1996， Pages 205-211.

[10] 刘艳冬.香猪NRAMP1 基因多态性及与仔猪腹泻相关性研究[D].贵阳：贵州大学， 2009.

[11] 顾永娟.猪NRAMP1基因与仔猪腹泻及其生产性状关系的研究 [D]. 哈尔滨：东北农业大学，2006.

[12] 吴宏梅，王立贤，程笃学，等.猪Nramp1 基因多态性与免疫功能的相关性[J].中国农业科学，2008，41(1)：215-220.

[13] 杨军，陈红颂，丁山河，等.3个外种猪Nramp1基因多态性研究[J].长江大学学报：自然科学版，农学卷，2009，6(4)：40-43.

[14] 赵 生国，赵海，潘虹，等.4猪种Nramp1基因第6内含子多态性研究[J].中兽医医药杂志，2012，31(5)：34-36.

[15] 罗文华.猪Nramp1基因内含子测序及Nramp1和FUT1基因多态性研究[D].广州：华南农业大学.2004.

[16] 李娟娟，马小军，王立贤，等.合作猪Nramp1基因第六内含子多态性分析[J].甘肃农业大学学报，2010，45(2)：10-13.

2015-06-04）

上海市种业发展项目地方畜禽遗传资源保护与开发关键技术研究和示范及上海市生猪现代农业产业技术体系项目

周文兵，男，江苏省宿迁市人，硕士研究生，研究方向为预防兽医学

朱建国,email: zhu_jg@sjtu.edu.cn