负载紫杉醇双配体纳米药物输送系统的体外生物性能评价

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(1.南华大学附属第二医院妇产科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院超声科)

·基础医学·

负载紫杉醇双配体纳米药物输送系统的体外生物性能评价

周兵1，廖海红2，陈艳2，张霞2*

(1.南华大学附属第二医院妇产科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院超声科)

目的体外评价带有叶酸和穿膜肽双配体的、负载紫杉醇纳米药物输送系统的生物性能。方法分别用H-F-P NPs、H-Tat-P NPs及H-F-Tat-P NPs孵育细胞，利用流式细胞仪定量评价细胞对带有不同配体纳米药物输送系统的摄取量。再用H-F-Tat-P NPs孵育细胞，利用激光共聚焦显微镜定性评价不同细胞对H-F-Tat-P NPs的摄取量。结果叶酸受体阳性表达的MDA-MB-231细胞摄取H-F-Tat-P NPs的量明显多于H-F-P NPs及H-Tat-P NPs。叶酸受体阴性表达的A549细胞摄取H-F-Tat-P NPs与H-Tat-P NPs的量多于H-F-P NPs。结论叶酸的靶向作用与穿膜肽的穿膜作用能够协同提高药物在靶细胞的聚集，进一步增强药物输送系统的治疗作用，为开发新型、高效药物输送系统提供基础。

紫杉醇； 穿膜肽； 叶酸； 纳米药物输送系统

细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一大类由10～30 个氨基酸组成、可以携带多种分子主动穿越各种生物膜屏障包括血脑屏障，导入近乎所有细胞的短肽[1]。自穿膜肽发现以来人们利用穿膜肽的转运功能已将蛋白质、抗体、核酸、脂质体、显像剂、细胞毒性药物等多类物质导入细胞，为许多疾病分子水平的诊断、治疗提供了有效手段，但普通穿膜肽缺乏靶向性制约了其进一步在体应用[2-3]。目前已经发现叶酸受体(folate receptor,FR) 在包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等在内的大部分恶性肿瘤组织中高度表达，而在正常组织中几乎不表达[4-5]。因此，叶酸可作为肿瘤特异分子应用于靶向药物输送系统的研究[6-8]。

结合前期已经成功制备了负载紫杉醇的双配体纳米药物输送系统(heparin-folate-tat-paclitaxel nanoparticles,H-F-Tat-P NPs)[9]，本研究体外评价该系统的生物性能，为进一步研究其体内生物活性，特别是开发具有高效治疗作用的药物输送系统提供基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器肝素钠(Mw=15000 Da，效价150 U/mg)，叶酸，丁二酸酐(上海国药集团)，732(H+)阳离子交换树脂(上海山浦化工有限公司)，4，4′‐二甲氨基吡啶(DMAP)，二环己基碳化二亚胺(DCC)，1‐乙基‐3(3‐二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(上海共价化学公司)，紫杉醇(沈阳天峰生物化学有限公司)，Tat肽Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(MW 1560 Da)，FITC-Tat肽(上海强耀生物科技有限公司)，SephadexG-25葡聚糖凝胶，透析袋(MWCO 3500)(Parmacia，瑞典)，所有试剂反应前均进行重蒸处理。人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549，RPMI 1640细胞培养基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、L-15细胞培养基(广州速研生物科技有限公司)，氯化钠(NaCl)、十二水合磷酸二钠(Na2HPO4·12H2O)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)(广州铭旺生物科技有限公司)，Bruker AVANCEAV 400核磁共振仪(美国布鲁克公司)，Zetasizer Nano-Zs动态光散射仪(DLS，英国Malvern公司)，UV-2410紫外光分光光度计(日本岛津仪器有限公司)，TOPCON DS150扫描电子显微镜，TF-FD-1冷冻干燥机(上海田枫仪器有限公司)，高效液相(HPLC，Shimadzu)，反向C18硅胶柱(SepaxHP-C18，4.6250 mm，5 m，Sepax，USA)，紫外检测器(SPD-20 A，Shimadzu)。细胞计数板、细胞培养皿、载玻片、盖玻片、移液器枪头、离心管、EP管、6孔板(广州杰特伟公司)，1 000 μL微量加样枪×1支、20～100 μL微量加样枪×1支、1～20 μL微量加样枪×1支(法国吉而森公司)，CP225D电子分析天平(Sartorius,Germany)，CO2孵箱(GALAXY S)，电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)，FACSort流式细胞分析仪(Becton Dickinson,USA)；激光共聚焦显微镜(Olympus fluoview fv1000,Tokyo,Japan)，低速离心机(LD5-2A)(Sigma,America)，LRH-150-S型恒温恒湿培养箱(广东省医疗器械厂)。

1.2 P NPs的制备参照前期制备方法制备H-F-P NPs、H-Tat-P NPs及H-F-Tat-P NPs[9]。

1.3细胞培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549置于37 ℃ 5% CO2饱和湿度恒温的细胞培养箱中培养，培养液分别为L-15、RPMI 1640，均含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素。每天更换培养液1次。

1.4流式细胞仪定量分析于6孔板内每孔加入约2.8×105个MDA-MB-231细胞或A549细胞，加入适量培养液放入孵箱培养24 h后吸去细胞培养液，加入2～3 mL PBS 缓冲液重复漂洗2～3遍，以去掉细胞代谢产物和死细胞；再分别加入H-F-P NPs 、H-Tat-P NPs 及H-F-Tat-P NPs放入孵箱孵育4 h。制备成细胞悬液后利用流式细胞分析仪定量分析细胞摄取情况，上机检测前将装有待测样品的流式管避光保存在冰里。

1.5激光共聚焦显微镜将2个盖玻片分别置于6孔板内，加入约3×104个MDA-MB-231细胞或A549细胞于每个盖玻片上，放入孵箱培养24 h后吸去盖玻片上的培养液，加入2～3 mL PBS 缓冲液重复漂洗2～3遍，以去掉细胞代谢产物和死细胞；再加入H-F-Tat-P NPs放入孵箱孵育4 h。细胞固定及染色后将盖玻片覆于载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。

2 结 果

2.1流式细胞分析仪定量分析细胞对载药纳米粒的摄取情况分别用H-F-P NPs、H-Tat-P NPs及H-F-Tat-P NPs作用于MDA-MB-231细胞和A549细胞，孵育4 h后，利用流式细胞分析仪定量分析细胞对载药纳米粒的摄取情况，结果发现叶酸受体表达阳性的MDA-MB-231细胞摄取H-F-P NPs及H-F-Tat-P NPs的量明显多于叶酸受体表达阴性的A549细胞，而MDA-MB-231细胞与A549细胞对H-Tat-P NPs的摄取量基本一致(图1)，叶酸受体表达阴性的A549细胞摄取H-F-Tat-P NPs及H-Tat-P NPs的量多于H-F-P NPs(图1b)，因此推测叶酸受体介导的胞吞作用及Tat介导的穿膜作用能够促进细胞对纳米粒的摄取，而Tat介导的穿膜作用可能与细胞种类无关。

2.2激光共聚焦显微镜定性分析细胞对载药纳米粒的摄取情况用H-F-Tat-P NPs分别作用于MDA-MB-231细胞和A549细胞，孵育4 h后，利用激光共聚焦显微镜定性分析细胞对载药纳米粒的摄取情况，结果发现MDA-MB-231细胞内绿色荧光强度强于A549细胞(图2)，推测叶酸受体介导的胞吞作用能够促进细胞对纳米粒的摄取。

图1 用H-F-P NPs 、H-Tat-P NPs 及H-F-Tat-P NPs作用于MDA-MB-231细胞和A549细胞4 h后的流式细胞图

图2 用H-F-Tat-P NPs分别作用于MDA-MB-231细胞和A549细胞，孵育4 h后的激光共聚焦图(60×) 左边为Hochest33342蓝色荧光标记的细胞核；中间为Oregon green488绿色荧光标记的H-F-Tat-P NPs；右边为两者的合并

3 讨 论

本研究选用叶酸受体表达阳性的乳腺癌细胞MDA-MB-231和叶酸受体表达阴性的肺癌细胞A549来评估负载紫杉醇的双配体纳米药物输送系统(FITC标记纳米粒) 的生物性能。结果显示叶酸紫杉醇纳米粒组及双配体紫杉醇纳米粒组MDA-MB-231细胞内荧光强度明显强于A549细胞，提示叶酸受体介导的胞吞作用可能促进细胞对纳米粒的摄取。两种细胞对Tat紫杉醇纳米粒的摄取量基本一致，提示Tat的穿膜作用可能与细胞种类无关。双配体紫杉醇纳米粒组与叶酸紫杉醇纳米粒组、Tat紫杉醇纳米粒组对比，MDA-MB-231细胞内绿色荧光强度明显增强，说明叶酸与Tat可能起协同作用。A549细胞在Tat紫杉醇纳米粒组及双配体紫杉醇纳米粒组细胞内荧光强度并无明显区别，且均强于叶酸紫杉醇纳米粒组，提示Tat可能促进细胞对纳米粒的摄取。

本研究用Oregon green绿色荧光标记纳米粒，Hochest33342蓝色荧光标记细胞核，进一步运用激光共聚焦纤维镜来观察肿瘤细胞对纳米粒的摄取情况。用双配体紫杉醇纳米粒作用于叶酸受体阳性表达的MDA-MB-231细胞和叶酸受体阴性表达的A549细胞，结果显示MDA-MB-231细胞内绿色荧光强度强于A549细胞，推测叶酸可能促进纳米粒进入肿瘤细胞内。

叶酸和穿膜肽共同修饰的纳米药物输送体系，能够协同促进肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，提高肿瘤细胞内药物浓度，从而有效抑制肿瘤细胞生长，其抑瘤效果优于单配体修饰的纳米药物输送系统，这为进一步体内实验打下基础。

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InvitroBiologicalActivitiesofPaclitaxelNanoparticleswithDualLigands

ZHOU Bing,LIAO Haihong，CHEN Yan，et al

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo evaluate in vitro biological activities of paclitaxel nanoparticles with dual ligands.MethodsThe cells were incubated with H-F-P NPs,H-Tat-P NPs,or H-F-Tat-P NPs,and then evaluated by using flow cytometry.Then the cells were incubated with H-F-Tat-P NPs,and evaluated by using confocal laser scanning microscopy.ResultsQuantitative analysis of cellular uptake of NPs by flow cytometry showed the extend of celluar uptake for A549 cell lines was:H-F-Tat-P NPs > H-Tat-P NPs > H-F-P NPs.For MDA-MB-231 cells:H-F-Tat-P NPs >H-F-P NPs> H-Tat-P NPs.Qualitative analysis of cellular uptake of H-F-Tat-P NPs by confocal laser scanning microscopy showed the fluorescent signal of NPs in MDA-MB-231 cells was higher than that of A549 cells under the same conditions.ConclusionThe strategy on nanomedicine with dual ligands can enhance the cellular uptake of drug thereby improve its chemotherapeutic efficiency.The nanoparticle system could be used as a promising cancer cell specific delivery system for further investigation.

folate； tat； paclitaxel； nanoparticle system

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.009

2015-05-19；

2015-06-14

*通讯作者，E-mail：290087808@qq.com.

R737.3

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(此文编辑：朱雯霞)