梅毒螺旋体金属蛋白酶水解纤维蛋白原的活性研究

(南华大学附属第一医院检验科，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

梅毒螺旋体金属蛋白酶水解纤维蛋白原的活性研究

刘双全

(南华大学附属第一医院检验科，湖南 衡阳 421001)

目的研究梅毒螺旋体金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质纤维蛋白原的水解能力，为深入研究TP的致病机制提供实验依据。方法采用两点法构建H198A突变型及H202A突变型Tp0751基因，分别构建野生型和突变型Tp0751原核载体进行诱导表达；体外实验检测Tp0751野生型Tp0751蛋白、H198A Tp0751突变型蛋白、H202ATp0751突变型蛋白对纤维蛋白原的降解活性。结果成功表达并纯化了野生型Tp0751蛋白、H198A Tp0751突变体蛋白、H202A Tp0751突变体蛋白，各蛋白相对分子量大小约为26kD；纤维蛋白原在与野生型Tp0751蛋白作用约24h后被完全水解；与H198A Tp0751突变体蛋白作用约24 h后部分水解，尚有部分未被降解；与H202A Tp0751突变体蛋白作用约24h后几乎不被水解。结论野生型Tp0751蛋白具有水解纤维蛋白原的作用；Tp0751蛋白水解纤维蛋白原的活性可能与金属蛋白酶HEXXH域相关,影响Tp0751蛋白对纤维蛋白原的降解的活性位点可能是202位的H而不是198位的H。

梅毒螺旋体； 金属蛋白酶； Tp0751； 水解活性

梅毒螺旋体(Treponema pallidum，Tp)是引起人类梅毒(syphilis)的病原体。梅毒是一种能造成成人严重全身性损害及胎儿的胎传梅毒的性传播性疾病(STD)[1-4]。居高不下的梅毒发病率引起了我国公共卫生部门乃至全球公共卫生部门的高度关注，控制本病的关键环节则是阐明Tp致病机制。感染宿主过程中，黏附是Tp感染机体的第一步，Tp穿透血管壁屏障后，如何防止血液凝固是Tp随血液循环播散至全身引起慢性感染的关键。血液凝固的关键过程是血浆中的纤维蛋白原转变为不溶的纤维蛋白。Houston[5]等发现Tp0751除了能结合宿主ECM外，还能降解人类纤维蛋白原。HEXXH活性区为金属蛋白酶活性域，其与细菌许多蛋白降解活性相关[6-9]。但是，Tp0751金属蛋白酶的水解活性是否与该区域有关尚有待研究和探索。为了探索Tp0751蛋白水解活性机制，本文对野生型及HEXXH活性区突变型Tp0751蛋白水解纤维蛋白原的活性进行研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

1.1.1 菌株与载体 Tp Nichols标准株、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)、PET-30a(+)质粒均为南华大学病原生物学研究所保存。

1.1.2 主要试剂 蛋白分子量标准，Ni-NTA亲和层析柱购自QIAGEN公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；卡那霉素购自上海生工生物工程公司；人纤维蛋白原购自美国Sigma公司。

1.1.3 主要仪器HEMA公司凝胶图像分析系统；北京六一仪器厂水平电泳仪；MP220超声细胞破碎仪；Beckman公司DU640核酸蛋白定量分析仪。

1.2 方法

1.2.1 野生型和突变型Tp0751重组表达载体的构建 野生型Tp0751重组质粒的构建：从GenBank中查询Tp0751基因序列，设计1对PCR扩增引物，由上海生工合成；以Tp Nichols株的基因组DNA为模板，PCR扩增Tp0751基因,构建pET30a(+)/Tp0751重组表达质粒(上述质粒构建由本课题组前期研究完成 )

H198A和H202A突变型Tp0751重组质粒的构建：从GenBank中查询Tp0751基因序列，针对Tp0751金属结构域HEXXH中的198位的H及202位的H，采用两点法分别设计2对PCR扩增引物,构建pET30a(+)/H198A Tp0751、pET30a(+)/H202A Tp0751重组表达质粒(上述质粒由北京博亚结晶生物科技公司构建)。

1.2.2 野生型和突变型Tp0751重组蛋白的表达、纯化 将pET30a(+)/Tp0751、pET30a(+)/H198A Tp0751和pET30a(+)/H202A Tp0751重组表达质粒转入表达菌E.coli BL21构建原核重组表达体，分别挑选单个阳性菌落，大量诱导表达重组蛋白；离心收集菌体，用超声波破碎菌体后离心收集上清上Ni-NTA亲和层析柱纯化，具体操作见说明书，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化产物。

1.2.3 野生型Tp0751蛋白、H198A突变型和H202A突变型Tp0751对Fg水解能力检测 将野生型Tp0751蛋白、H198A和H202A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30 μg，Fg中终质量为60 μg，反应总体积为100 μL)，SDS-PAGE检测Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。

2 结 果

2.1野生型、H198A突变型和H202A突变型Tp0751重组蛋白的表达、纯化挑选阳性重组表达菌进行IPTG诱导表达；SDS-PAGE分析发现在分子量约为26 KD处有一明显蛋白条带，与预期的分子量大小相符(图1)；重组蛋白经纯化后，蛋白纯度在90%以上。

图2 H198A突变型Tp0751蛋白纯化结果图 1：蛋白Mark；2：洗涤液洗涤第一次；3：洗涤液洗涤第二次；4：洗脱液洗脱第一次；5：洗脱液洗脱第二次

图3 H202A突变型Tp0751蛋白纯化结果图 1：蛋白Mark；2：洗涤液洗涤第一次；3：洗涤液洗涤第二次；4：洗脱液洗脱第一次；5：洗脱液洗脱第二次

2.2野生型Tp0751水解纤维蛋白原的活性野生型Tp0751蛋白水解纤维蛋白原反应总体积为100 μL，包括30 μg 野生型Tp0751蛋白，60 μg Fg，反应0 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h后，分别留取反应产物，与5×蛋白上样缓冲液混匀后，100 ℃,5 min，跑SDS-PAGE蛋白胶分析，结果如图4所示：Fg在与Wt-Tp0751反应6 h后开始出现明显降解，在反应12 h后Fg基本上被完全降解，且Wt-Tp0751目的蛋白逐渐减少并出现了多条小分子降解蛋白条带。

图4 wt-Tp0751蛋白水解Fg结果图 1：蛋白Mark；2：反应0 h后；3：反应1 h后；4：反应2 h后；5：反应4 h后；6：反应6 h后；7：反应8 h后；8：反应12 h后；9：反应24 h后

2.3 H198A突变型Tp0751水解纤维蛋白原的活性水解结果如图5所示：Fg在与H198A突变型Tp0751 6 h后逐渐开始出现降解，但是反应24 h后，尚存明显的未被降解的蛋白带。

2.4 H202A突变型Tp0751水解纤维蛋白原的活性水解结果如图6所示：Fg在与H202A突变型Tp0751蛋白作用24 h后，Fg基本上未被降解，突变型Tp0751蛋白也未见明显降解。

图5 H198A突变型Tp0751蛋白水解Fg结果图 1：蛋白Mark；2：反应0 h后；3：反应1 h后；4：反应2 h后；5：反应4 h后；6：反应6 h后；7：反应8 h后；8：反应12 h后；9：反应24 h后

图6 H202A突变型Tp0751蛋白水解Fg结果图 1：蛋白Mark；2：反应0 h后；3：反应1 h后；4：反应2 h后；5：反应4 h后；6：反应6 h后；7：反应8 h后；8：反应24 h后

3 讨 论

Tp本身的代谢能力低下无法进行体外的连续人工培养、缺乏遗传可操作系统和外膜易脆性导致人们对Tp不能进行遗传操作，严重阻碍了人们从分子水平对Tp致病机制的研究[10]。Tp全基因序列解析[2]极大的促进了人们对Tp基因结构与功能的研究。Tp在感染宿主过程中，粘附是Tp感染机体的第一步，也是Tp在体内定植和扩散的关键因素。Tp除了能黏附于许多宿主细胞上[4,10-14]，还能结合细胞外基质；介导Tp与宿主细胞黏附的主要介质之一便是细胞外基质；导致梅毒广泛传播的主要原因则是Tp与各种细胞外基质的结合。目前已证实Tp0483[12]、Tp0136[15]、Tp0751[11,14]能吸附宿主细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等，这些蛋白被认为是Tp的粘附素，其中最为重要、研究最多的是粘附素Tp0751。

最新研究表明Tp0751是具有双重生物学功能的膜相关酶，不但参与粘附，还是一种依赖锌的具有金属酶样活性的能水解组织成分的蛋白，其与Tp感染后扩散密切相关[5]。HEXXH活性区为金属蛋白酶金属离子依赖的活性区，其与细菌许多蛋白降解活性相关。Tp0751金属蛋白酶的水解活性是否与该区域有关尚有待研究和探索。本研究拟通过构建和表达野生和突变型Tp0751蛋白，分别对其水解Fg的活性进行研究，进行其金属酶水解活性区的探索，为深入研究Tp致病机制奠定基础和提供实验依据。

本研究通过体外研究野生型Tp0751蛋白及其突变体蛋白对人纤维蛋白原Fg的水解情况，从蛋白结构方面入手进而研究其水解细胞外基质成分的能力；本研究选择了金属蛋白酶结构域HEXXH中198位的H及202位的H作为突变位点,Tp的天然宿主人类的细胞外基质成分纤维蛋白原作为基质，通过定时吸取目的蛋白与纤维蛋白原反应物进行SDS-PAGE分析显示Fg水解程度的判断，从而确定目的蛋白的水解能力。

研究结果显示：蛋白与纤维蛋白原反应24小时后，与wt-Tp0751蛋白作用的纤维蛋白原能被完全降解；而与H198A突变体蛋白作用的纤维蛋白原还有明显的未被降解的蛋白带存在；与H202A突变体蛋白作用的纤维蛋白原则基本上未被降解。同wt-Tp0751相比，H198A突变体蛋白水解Fg的活性明显减弱，但仍存在一定的水解能力，H202A突变体蛋白几乎不存在水解Fg的能力。结果提示Tp金属蛋白酶HEXXH结构域中，202位H可能与Tp0751降解细胞外成分的活性有关，而108位的H可能与之降解活性无关，但是至于该结构域其它位点是否也与蛋白水解活性有关，各位点间对Fg的水解是否存在协同作用亦或是抑制作用我们尚不得而知。为了进一步探索其水解活性功能域，有必要对HEXXH结构域其它位点突变体蛋白对蛋白水解Fg能力进行研究。

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TheFibrinolyticPotentialofTreponemaPallidumMetalloprotease

LIU Shuangquan

(TheFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the fibrinolytic potential of Treponema pallidum metalloprotease Tp0751,providing the experimental basis for further research on syphilis pathogenic mechanism.MethodsConstructed the H198A mutant Tp0751 and H202A mutant Tp0751 with two-point technology.Wide-type and Mutant Tp0751 recombinant protein were expressed in E.coli BL21.And detected their degradation activity to fibrinogen.ResultsThree fusion protein with molecular weight about 26KDa were attained after expression and purification,The wild type Tp0751 can degradate plasminogen-free human fibrinogen,fibrinogen was absolutely degradated 24h post-incubation,The H198A mutant Tp0751 can also degradate plasminogen-free human fibrinogen,but which was partly degradated 24h post-incubation;The H202A mutant Tp0751 can not degradate plasminogen-free human fibrinogen,fibrinogen was scarcely degradated 24h post-incubation.ConclusionThe wild type Tp0751 can degradate plasminogen-free human fibrinogen,The HEXXH motif may have a important role on Tp0751 to the degradation of plasminogen-free human fibrinogen,residue H202,but not H198,from the pallilysin HEXXH motif is required for fibrinogen degradation.

Treponema pallidum; metalloprotease; Tp0751; fibrinolytic potential; Pathogenic mechanism

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.003

2015-04-10；

2015-06-30

国家自然科学基金(No.81201331)；湖南省自然科学基金重点项目(No.11JJ4076)；湖南省教育厅青年基金(No.11B107).

R377.1

A

(此文编辑：秦旭平)