万古霉素及其杂质的亲水作用色谱分析

闫竞宇 ， 郭志谋， 丁俊杰， 沈爱金， 王纪霞， 金高娃， 梁鑫淼

（中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，辽宁 大连116023）

万古霉素（vancomycin，VAN）是由东方链酶菌（Streptomyces orientalis）产生的一种糖肽类抗生素，目前临床上主要用来治疗严重的革兰氏阳性菌感染，是治疗由金葡菌引起的严重感染的首选药物［1］。由于万古霉素具有较好的抗菌作用，除作为药物使用外，其还常被作为饲料添加剂使用，为防止抗生素滥用引起耐药性问题，各个国家都制定了相应的食品残留限量标准［2］。因此，无论对万古霉素类药物的质量控制［3，4］、药代动力学研究［5，6］，还是对食品、饲料中万古霉素类抗生素的非法添加的检测［7］，都需要发展合适的色谱分析方法。

万古霉素分子由两个结构单元组成（见图1），即亲水的糖基部分（氨基糖、葡萄糖）和疏水的肽基部分（7 个氨基酸交联而成的三环刚性骨架），同时，分子既含有碱性的伯氨基团，又含有酸性的羧基。万古霉素的结构特征对色谱分离效率和峰形带来了较大的挑战。此外，万古霉素由发酵产生，发酵过程会产生较多的结构类似物，万古霉素本身也可产生降解杂质，其降解杂质如CDP-1 可引起严重的不良反应［8］，对这些杂质的分离需要较高的分离选择性。当前，对万古霉素色谱分析主要采用反相色谱法，以C18 柱为色谱固定相，采用磷酸三乙胺-乙腈-四氢呋喃为流动相体系可获得较好的万古霉素峰形和对部分杂质的分离选择性。考虑到上述方法的质谱兼容性和分离选择性问题，Hoogmartens 等［9，10］对万古霉素分析方法进行了改进，通过优化不同种类的缓冲盐、有机溶剂及改变溶剂体系的pH 值来改善分离选择性，分别采用二氧六环-甲酸铵流动相体系和甲醇-乙酸铵体系实现对万古霉素及主要杂质的分离和质谱鉴定，改进后的体系可与质谱兼容，但仍存在分离选择性不足的问题。Adams 等［11］针对万古霉素杂质分离问题，筛选了69 种不同厂家的C18 色谱柱，通过色谱柱参数比对，给出了分离万古霉素样品时色谱柱选择的参考因素。由此可见，由于万古霉素分子结构较为特殊，结构类似物多，优化后的反相方法仍不能够提供足够的分离选择性，推测其原因是反相固定相不能提供足够的极性选择性。

近年来得到巨大发展的亲水作用色谱方法［12-16］为极性化合物的分离提供了新的途径，其具有极性选择性好，质谱兼容性高的特点。万古霉素类化合物本身带有较强的极性基团，在亲水作用色谱上应该可以实现较好的保留，但目前对万古霉素类化合物亲水作用色谱保留行为的研究尚未见报道。本文以万古霉素及主要杂质为研究对象，通过筛选亲水固定相、考察不同流动相条件对保留性质的影响，开展该类物质亲水保留特性研究，为万古霉素及其结构类似物的亲水分离方法的发展提供了依据和指导。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Alliance 高效液相色谱仪（Waters，Milford，MA，USA），包括2695 分离单元、自动进样器、柱恒温系统和2489 紫外检测器。乙腈为Merck 公司（Darmstadt，Germany）产品，实验室用水来自Milli Q 纯水净化系统（Billerica，MA，USA），甲酸、甲酸铵为Acros 公司（Fair Law，NJ，USA）产品。万古霉素（vancomycin B）、desvancosaminyl vancomycin（DESV）、双去氯万古霉素（dedichloro vancomycin，DDCV）、crystalline degradation product （CDP-1）标准品均购自Toronto Research Chemicals Inc. （Brisbane，Toronto，Canada），去甲万古霉素（norvancomycin，NORV）购自中国食品药品检定研究院（北京）。

TSK gel Amide-80 柱购自日本Tosoh 公司。Atlantis HILIC 柱购自Waters 公司（Milford，MA，USA）。ZIC-HILIC 购自Merck 公司（Darmstadt，Germany）。Click Maltose 柱为实验室自制。Venusil HILIC 为北京艾杰尔公司产品。Click XIon为北京华谱新创科技有限公司产品。以上色谱柱规格均为150 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 色谱条件

1.2.1 色谱柱的筛选

色谱柱温度设定为30 ℃，流动相流速为1.0 mL／min；流动相A 为乙 腈，B 为 水，C 为100 mmol／L 甲酸铵（pH 3.2）；梯度洗脱程序：保持10% C 不变，0 ～30 min 由10% B 升至40% B；检测波长设定为254 nm。

1.2.2 流动相中乙腈含量的影响

使用三元流动相体系，保持C 相缓冲盐恒定为10%，通过调节A 和B 的比例改变乙腈含量。

1.2.3 流动相中pH 的影响

配制100 mmol／L 甲酸铵，通过调节甲酸加入量使pH 分别为3.2、4.2、5.0，使用三元流动相体系，等度洗脱，保持65% A 和25% B 不变，更换C 相溶液。

1.2.4 流动相中盐浓度的影响

使用三元流动相体系，保持65% A 不变，通过调节B 和C 的比例改变缓冲盐浓度。

1.2.5 万古霉素及其杂质的亲水分离

使用三元流动相体系，梯度洗脱程序：保持10% C 不变，0 ～40 min 由18% B 升至23% B，40 ～50 min 由23% B 升至25% B。

2 结果与讨论

2.1 杂质标准品的选择

万古霉素为发酵生产得到，同时还会产生大量的结构类似物，本文选取了万古霉素产品中较为常见的几个杂质，结构式如图1 所示。NORV 相较于万古霉素丢失一个甲基结构，DESV 为万古霉素失去一个氨基糖单元，DDCV 是万古霉素失去两个氯原子。CDP-1 是万古霉素降解重排之后产生的杂质，其含有两个同分异构体，分别为CDP-1-M 和CDP-1-m，该杂质会引发毒副作用，在万古霉素质量分析中需要严格控制。所选的杂质标准品极性都与万古霉素相近，以此考察亲水作用色谱法对结构类似物的选择性。

2.2 色谱柱的筛选

本文筛选了6 种常见的亲水作用色谱柱，包括TSKgel Amide-80、Atlantis HILIC、ZIC-HILIC、Click Maltose、Venusil HILIC、Click XIon 色谱柱，这些固定相包含了硅醇基、两性离子、酰胺、麦芽糖等不同键合相，能够提供不同的分离选择性。通过考察相同实验条件下对万古霉素及其杂质标准品的分离，获得保留特性，进而选择分离选择性好，亲水性强的色谱固定相。表1 列举了不同色谱柱对万古霉素及主要杂质的色谱保留时间。从万古霉素及其杂质的保留看，所选择的6 种色谱柱选择性类似，出峰顺序遵从极性从小到大的顺序。DESV 比万古霉素少一个糖基，故极性减小，先出峰，而CDP-1 重排后，相较于万古霉素多生成一个羧基，故极性增大，去甲万古霉素和去氯万古霉素均因为去掉非极性基团（如甲基、氯原子）而使整个分子极性增强。不同色谱柱的亲水性有所差别，从保留时间看，Atlantis HILIC 保留最弱，Click XIon 柱保留最强。CDP-1 为一对同分异构体，只有ZIC-HILIC 色谱柱在此条件下能将两个异构体完全分离，但其对万古霉素、去甲万古霉素和CDP-1 的分离度明显不够。为使万古霉素和杂质能够有更充分的调节空间和最大的分离度，最后选择保留最强的Click XIon 柱进行流动相条件的考察和优化。

表1 万古霉素及其杂质在不同色谱柱上的保留时间Table 1 Retention times of vancomycin and its related impurities on different columns min

2.3 万古霉素及其杂质在Click XIon 柱上的色谱保留行为研究

2.3.1 流动相中乙腈含量对溶质保留值的影响

在亲水作用色谱模式下，乙腈／水比例对溶质的保留影响最大。研究保留值和乙腈含量的关系，对于理解万古霉素及其杂质在Click XIon 柱上的色谱保留机理具有一定的指导意义。如图2 所示，万古霉素及其杂质的保留均随乙腈含量的增加而增加，表现出典型的HILIC 模式特征。同时，从图中各曲线的变化率看，该类物质的保留随乙腈含量变化幅度均较大，即表现出对乙腈含量的变化较为敏感，这可能与该类物质的分子较大有关。

图2 万古霉素及其杂质的保留因子随乙腈含量的变化图Fig.2 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus acetonitrile content in the mobile phase

为进一步了解其保留机理，依据吸附机理保留值方程（1）［17，18］，考察了ln k（k 为化合物的保留因子）和ln CB（CB为水的体积分数）的关系。具体的回归系数见表2。从线性回归系数（R2）上看，除保留最弱的DESV 的线性系数低于0.999 0，其余4 个物质都能很好地用该方程进行拟合，就此推测万古霉素及其杂质在Click XIon 色谱柱上的保留除分配作用以外，还存在与固定相之间的直接的相互作用，例如静电作用、氢键作用、偶极作用等。

表2 万古霉素及其杂质基于方程（1）得到的回归结果Table 2 Results of regression equations of vancomycin and impurities based on equation （1）

2.3.2 流动相pH 对溶质保留值的影响

流动相pH 值对溶质的保留具有重要影响，万古霉素及其杂质带有多个极性官能团，流动相pH的改变会影响不同极性官能团的电离状态，进而改变其保留行为。在不同pH 的流动相条件下，两性离子固定相Click XIon 柱所带电性也会有所变化［19］。采用65% 乙腈，保持10 mmol／L 缓冲盐浓度，调节甲酸铵-甲酸缓冲盐体系的pH，分别考察了pH 3.2、4.2、5.0 条件下的分离效果。如图3 所示，除DESV 外，万古霉素及其杂质的保留均随流动相pH 的增加而增强。推测这是由于当pH 增大时，固定相由正电性转为负电性，与万古霉素及其杂质的静电作用增强，故保留增强。DESV 相较于其他化合物没有产生静电作用的氨基糖结构，故保留未受pH 影响。这也进一步证实了万古霉素及其杂质在亲水作用色谱中是多种作用力下的保留机理。

图3 万古霉素及其杂质的保留因子随流动相pH 的变化图Fig.3 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus pH of the mobile phase

2.3.3 流动相中盐浓度对溶质保留值的影响

在亲水作用色谱中，缓冲盐的浓度会影响溶质的保留时间，也可能改变固定相对溶质的分离选择性。为了解缓冲盐浓度对万古霉素及其杂质保留和选择性的影响，考察了不同盐浓度下各物质的保留时间。由乙腈含量实验可知，万古霉素及其杂质在乙腈含量为65% 时，保留时间适宜，且各杂质之间可得到较好的分离，故本研究采用65% 乙腈。由于万古霉素及其杂质的保留随pH 增加而增强，为了更好地反映盐浓度的影响，在静电作用力最弱的pH 3.2 条件下开展实验，通过改变水相和盐相（100 mmol／L 甲酸铵，pH 3.2）比例，调节不同盐浓度。如图4 所示，除CDP-1 外，万古霉素及其杂质的保留随缓冲盐浓度变化不明显，这与大多数小分子样品在亲水作用色谱保留中所展现的保留值随盐浓度增大而增加的现象［20］不一致，推测原因为万古霉素及其杂质与固定相的静电吸引作用随盐浓度增加而降低，刚好与由盐浓度增加导致的保留增强的作用相反，二者共同作用的结果为保留几乎没有发生明显变化。而随盐浓度的增加，杂质CDP-1 的保留有所下降，推测其原因为CDP-1 相较于万古霉素分子，重排后生成了一个羧基，致使CDP-1 与固定相的静电吸引作用增加，当盐浓度增加时，削弱了其与固定相的离子交换作用，故保留有所降低。在对比不同盐浓度下万古霉素及其杂质的分离度和保留后，10 mmol／L 盐被认为是较适宜的盐浓度。

图4 万古霉素及其杂质保留因子随缓冲盐浓度的变化图Fig.4 Plots of retention factors versus salt concentration in the mobile phase

2.4 万古霉素及其杂质在亲水作用色谱模式下的分离

通过以上对万古霉素及其杂质的亲水保留性质的研究可知，万古霉素及其杂质在两性离子色谱柱上的保留较好，其保留随乙腈含量、pH 值变化较大，随盐浓度变化不大。根据万古霉素及其杂质的保留性质，优化分离方法，使万古霉素及其杂质能够在较短的时间内实现基线分离。图5 为采用添加甲酸铵的流动相梯度条件下对万古霉素及主要杂质的分离。从图5 可以看出，虽然万古霉素和几个主要杂质的分子差别较小，保留性质较为相近，但在当前优化的条件下仍可实现较好的分离。CDP-1 为两个同分异构体，在该条件下，两个峰有一定的分离趋势，保留时间越长，二者的分离度越大；考虑到分析时间不宜过长，未继续延长时间改善其分离度。由于购买的杂质标准品纯度不高，仍可见其他杂质峰存在，均与万古霉素实现较好的分离，体现了亲水作用色谱在万古霉素与杂质的分离中具有一定的优势。同时，该方法采用了质谱兼容的乙腈-甲酸铵体系，可以直接用于对未知杂质的鉴定。但是，从峰形上看，万古霉素、去甲万古霉素和去氯万古霉素峰均存在一定程度的前伸，对分离效率和分离度造成不利影响。因此，HILIC 固定相和方法仍需要进一步筛选和优化，以改善峰形和提高分离度。

图5 万古霉素及其杂质的HILIC 谱图Fig.5 HILIC chromatogram of vancomycin and its related impurities

3 结论

本文以万古霉素及其4 个常见杂质为研究对象，探索了万古霉素类抗生素的亲水作用色谱保留行为。通过对比万古霉素及其杂质在不同亲水键合色谱柱上的保留时间，选取了两性离子Click XIon色谱柱为固定相。通过考察流动相中有机相比例、盐浓度及pH 值对万古霉素及其杂质保留的影响，初步探讨了该类物质的亲水保留机制及影响因素，并优化得到乙腈-甲酸铵（pH 3.2）的流动相体系，实现了万古霉素及其杂质的有效分离。亲水作用色谱方法分离万古霉素及其杂质，可以获得较好的保留和分离，质谱兼容性好，可弥补反相色谱极性选择性差的缺点，为该类化合物分离提供了新的方法和思路。

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