超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速筛查水产品中15 种碱性合成色素

黄 鹂， 戴意飞， 王萍亚， 周 勇， 赵巧灵 ， 蒋玲波， 罗海军

（舟山市食品药品检验检测研究院，舟山市质量技术监督检测研究院，浙江 舟山316021）

近年来，违法使用碱性橙、罗丹明B、孔雀石绿等工业碱性合成色素的食品安全问题尤为突出。这些工业碱性色素具有较强的致毒、致癌作用，由于色彩丰富、价格低廉、着色稳定，被某些不法分子非法添加在食品中，对人民健康和社会稳定造成危害，成为食品安全领域内的高危风险因子。因此，目前关于食品中碱性橙、罗丹明B、孔雀石绿等碱性色素的检测方法越来越受关注，已有较多报道［1-7］。

近几年有关色素的检测方法层出不穷，主要有分光光度法［8］、薄层色谱法［9］、毛细管电泳法［10］、示波极谱法［11］、酶联免疫吸附分析法［12］、高效液相色谱法［13-16］、液相色谱-串联质谱法［17，18］等，由于不同色素的极性不同，导致现有的检测方法在高灵敏度和高效方面具有一定的局限性。

四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）能提供精确质量数，可通过分子质量数的匹配对化合物进行鉴定和确证，现在已开展了部分研究，如奶酪中色素的分析［19］、饮料中色素的快速检测［20］。但是目前使用Q-TOF MS 对于食品中未知添加物的筛查研究总体上比较少，尤其是对水产品中的色素筛查未查到相关报道。因此，本文以水产品为研究对象，对其中15 种禁用的碱性合成色素进行分析，并对样品前处理方法、液相色谱条件、质谱条件进行优化，以期建立水产品中多种色素的UPLC-Q-TOF MS 快速高效的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent UHPLC 和Agilent 6540-QTOF（Agilent公司，美国）；Avanti®J-E 高速冷冻离心机、Talboys 涡旋混合器、N-EVAPTM-112 氮吹仪、样品萃取管；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸为色谱纯，均购自上海安谱实验科技股份有限公司；无水硫酸镁、乙酸铵为分析纯；C18填料（40～63 μm）、硅胶粉（40～63 μm）均购自上海安谱实验科技股份有限公司；阳离子交换小柱（Oasis MCX）、弱阳离子交换小柱（Oasis WCX）均购自Waters 公司；C18小柱购自上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水为Milli-Q 超纯水。

标准品：金胺（Auramine O，纯度89%）、隐性孔雀石绿（Leucomalachite Green，纯度90%）、孔雀石绿（Malachite Green，纯度89%）、苏丹红III（Sudan III，纯度91%）、苏丹红IV （Sudan IV，纯度91%）、苏丹黄（Butter Yellow，纯度89%）、苏丹黑B（Sudan Black B，纯度91%）、碱性橙II（Chrysoidine G，纯度89%）、罗丹明B（Rhodamine B，纯度91%）、苏丹橙（Sudan Orange G，纯度89%）、苏丹红7B （Sudan Red 7B，纯度91%）、苏丹红G（Sudan Red G，纯度91%）、苏丹红I（Sudan I，纯度91%）、苏丹红II（Sudan II，纯度91%）、橘红2 号（Citrus Red 2，纯度91%），均购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取15 种碱性合成色素标准品各10 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 g／L的单标准储备液（-20 ℃保存），再分别吸取1 g／L的15 种单标准储备液各1 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容得10 mg／L 的混合标准溶液。实验中使用初始流动相溶液将其稀释成相应的标准工作溶液，于4 ℃保存。

1.3 样品前处理

称取2.0 g 样品于50 mL 带盖聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 乙腈（含有1%（v／v）乙酸）溶液，涡旋1 min，超声5 min，以10 000 r／min 冷冻离心10 min，取5 mL 上清液转移至基质分散管中，管内装有C18复合硅胶吸附剂（500 mg 无水硫酸镁、100 mg C18粉末、40 mg 硅胶粉末），振荡基质分散管5 min，以10 000 r／min 冷冻离心10 min，取离心后的上清液3 mL，经氮气吹干，用甲醇-水（50 ∶50，v／v）溶解并定容到1 mL，过0.22 μm 有机滤膜后供UPLC-Q-TOF MS 分析测定。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件

Agilent Eclipse Plus-C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）作为分析柱，柱温为30 ℃；流动相：A 相为5 mmol／L 乙酸铵-0.1%（v／v）甲酸水溶液，B 相为乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min，5%B～20%B；1～10 min，20%B ～100%B；10 ～15 min，100%B。进样体积为3 μL，流速为0.2 mL／min。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子（ESI）源；扫描方式：正离子全扫描；全扫描范围：m／z 50 ～1 100；毛细管电压：4 000 V；离子源喷雾电压：250 V；离子化电压：130 V；鞘气温度：350 ℃；干燥气温度：325 ℃；鞘气流速：11 L／min；干燥气流速：8 L／min；数据采集模式：全息离子扫描（All ions MS／MS）。参比溶液中含三氟乙酸（C2HF3O2，其精确相对离子质量为112.985 5）和六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮的加氢离子（C18H19F24N3O6P＋3，其精确相对离子质量为922.009 8）。

数据采集与处理通过Agilent Mass Hunter Workstation Software （Version B.05.00）软件完成，碎片离子数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager （B.04.00）软件完成。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱分析

本文以隐性孔雀石绿、苏丹红III 等为代表的15 种在水产品中禁用的碱性合成色素为研究目标物进行检测，依据它们的相对分子质量和理化性质的差异，结合应用UPLC 技术进行色谱分离，Q-TOF MS 进行质谱信息采集。图1 是15 种碱性合成色素的分子特征提取色谱图，并由All ions MS／MS 模式收集15 种目标物的母离子及保留时间等信息（见表1）。通过实验获得的质谱信息并结合Agilent Mass Hunter 软件对目标物进行质谱库对比，以保留时间、母离子和碎片离子精确质量数、同位素丰度模型进行比对确证，以母离子用于定量分析。由于方法中的碎片匹配采用了二级全离子图谱匹配，所以匹配度比一般用特征子离子的方式有更高的可靠性和准确度，效果更好，使得筛查的准确度更高。

图1 15 种碱性合成色素的UPLC-Q-TOF MS 提取离子色谱图Fig.1 Extracted chromatograms of the 15 basic artificial dyes by UPLC-Q-TOF MS

表1 水产品中15 种碱性合成色素的保留时间和质谱信息Table 1 Retention times and MS information for the 15 basic artificial dyes in fishery products

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

提取溶剂的优化需同时考察目标化合物和样品基质的特性，合适的提取剂可有效分离目标物与基质杂质，从而增加对样品中目标物的检测灵敏度。本实验比较了4 种有机溶剂——乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮，研究分析表明，乙腈最适合作为水产品中碱性合成色素的提取剂，回收率最高，达到90%。乙腈适用范围广，它不仅减少了对基质中油脂的溶解，且可有效沉淀蛋白质，减少杂质对色素的干扰。二氯甲烷因溶剂密度大，提取液分布于底层，增加操作难度，回收率为82%；此外，以丙酮和乙酸乙酯提取色素时，回收率偏低，均在60% 以下。在确定了最优提取剂的基础上，本文进一步分析了加入1%（v／v）乙酸的乙腈溶液对色素的提取效率，结果显示加入乙酸后提取剂不仅保持了较好的回收率（达到96%），且能使目标物离子化，为下一步提取液的分离净化处理奠定了良好基础。因此，本文确定最优提取溶剂是含1%（v／v）乙酸的乙腈溶液。

2.2.2 净化方法的优化

本实验选用3 种常用的固相萃取柱（C18柱、Oasis WCX 柱、Oasis MCX 柱）和C18复合硅胶基质萃取管对水产品中色素的提取分离效率进行比较分析，样品中色素的回收率结果见表2。由表2 可知，以C18复合硅胶基质萃取管为净化载体时，样品中色素的回收率最高，分析原因可能有以下几个方面：①C18固相萃取小柱具有强疏水性，但吸附性较弱，导致15 种碱性合成色素回收率较低（在60%～75%之间）；②弱阳离子交换柱和阳离子固相萃取小柱平均色素回收率为85.13%和74.09%，但对个别目标物如碱性橙II、苏丹红II 等的吸附能力较弱，达不到检测方法要求的高通量检测要求；③从表2 可以看出，自制C18复合硅胶混合基质萃取管对15 种碱性合成色素的平均回收率高达96.58%，它通过不同吸附剂对目标物进行针对性的保留，有效地去除杂质干扰，提高了碱性合成色素的净化效率，缩短了检测周期。同时对于萃取管中吸附剂的量进行了考察，结果发现：无水硫酸镁的量在500 mg 及以上时处于过饱和状态，达到良好的盐析效果；当C18和硅胶的配比为100 mg ∶40 mg 及以上时，对于回收率和净化效果不再有明显的促进效果，因此考虑到成本及效果，最终选择了吸附剂的使用量为500 mg无水硫酸镁、100 mg C18粉末、40 mg 硅胶粉末。因此，本文确定使用C18复合硅胶基质萃取管作为净化载体，从而使15 种碱性合成色素物质有较好的回收率，为水产品中色素的检测方法提供了一个快速有效的净化手段。

表2 不同萃取柱对水产品中15 种碱性合成色素的加标回收率及相对标准偏差的影响（n＝6）Table 2 Influence on the spiked recoveries and RSDs of the 15 target compounds in fishery products by different SPE cartridges （n＝6）

2.3 方法学确证

2.3.1 标准曲线、检出限与精密度

配制0.1 ～500 μg／L（0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg／L）的混合标准溶液，以分子离子峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，μg／L）分别绘制15 种碱性合成色素的标准曲线，并将10 μg／L 混合标准溶液平行测定6 次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD），结果见表3。从表3 可知，15 种碱性合成色素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）≥0.993；RSD≤6.49%，说明仪器精密度良好。

表3 15 种碱性色素的线性范围、线性方程、相关系数（r）和10 μg／L 时峰面积的相对标准偏差（RSD）Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r）and relative standard deviations （RSDs）of the 15 basic artificial dyes at 10 μg／L

2.3.2 检出限、定量限与回收率

本文中的检出限与定量限是根据3 倍和10 倍信噪比的要求进行测定和计算的。实际操作中，我们根据10.0 μg／kg 的添加回收试验（苏丹红III 和苏丹红IV 的加标量分别为100.0 μg／kg 和50.0 μg／kg）中目标化合物检测到的色谱峰进行3 倍信噪比的换算，最后确定为检出限（LOD，S／N ＝3），而该色谱峰经10 倍信噪比换算得到的含量为定量限（LOQ，S／N ＝10），最终通过采用初始流动相来稀释，直到信噪比分别达到3 和10 时的含量，进行最终各目标物的检出限和定量限的验证。如表4 所示，15 种目标物的LOD 在0.05 ～2.0 μg／kg 之间（苏丹红III 和苏丹红IV 的检出限分别为50.0 μg／kg 和25.0 μg／kg），同时15 种色素的定量限小于5.0 μg／kg（苏丹红III 和苏丹红IV 的定量限分别为100.0 μg／kg 和50.0 μg／kg）。

在阴性的鲳鱼样品基质中添加10、50 和200 μg／kg 3 种不同浓度水平的15 种混合标准溶液（苏丹红III 和苏丹红IV 的添加浓度分别为100、500、20 000 μg／kg），按1.3 节方法进行预处理，采用UPLC-Q-TOF MS 测定提取液中的目标化合物，且每个水平重复测定6 次，计算平均回收率及RSD，结果见表4。由表4 可知，在不同加标浓度范围内，15 种碱性合成色素的回收率为80.60%～107.37%，RSD 为3.33%～6.69%。由15 种碱性合成色素的检出限、定量限和回收率的实验结果，可以看出本方法满足快速筛查水产品中15 种碱性合成色素的需要。

表4 15 种碱性合成色素的回收率、RSDs、检出限和定量限Table 4 Recoveries，RSDs，limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the 15 basic artificial dyes

2.3.3 方法应用

选取市售22 份水产品——白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鱼免鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤作为方法验证样品基质，并做了添加回收质控样（鲳鱼样品，模拟水平200 μg／kg），结果未发现阳性样品，质控样回收率均大于80%。下一步将以水产制品为采集对象，扩大筛查范围和样品种类。

将添加回收质控样以UPLC-Q-TOF MS 技术检测分析，得到总离子流图，对目标物进行相对分子质量及标准物质谱图数据库检索，结果可知15 种碱性合成色素化合物的匹配度均较高，其匹配度在85%以上。结果表明，经过乙腈和乙酸混合液提取和C18复合硅胶基质萃取管净化，15 种碱性合成色素能够被UPLC-Q-TOF MS 有效筛查出来。

3 结论

本文利用C18复合硅胶基质萃取管提取净化，结合UPLC-Q-TOF MS 技术，建立了水产品中15 种碱性合成色素的快速检测方法。样品前处理优化了提取剂和萃取柱种类的选择，对水产品中不同性质的合成色素进行了有效提取分离；并利用了Q-TOF MS 的精确质量数定性功能对不同种类的色素化合物进行筛查。与目前已报道的方法相比，前处理简便、快捷、高效，数据采集和数据库建立采用全息离子扫描的方式进行，所有二级碎片的精确质量和丰度都能用来匹配，适用于水产品中15 种碱性合成色素的快速筛选。

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