超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱检测和鉴定猪尿中氯丙那林的主要代谢产物

毕言锋 ， 王亦琳， 叶 妮， 孙 雷， 王鹤佳， 徐士新， 肖希龙

（1. 中国兽医药品监察所，国家兽药残留基准实验室，北京100081；2. 中国农业大学动物医学院，北京100193）

β-肾上腺受体激动剂（β-adrenergic agonists，β-AAs）是临床上常用的一类平喘药物。有研究发现，当使用剂量是推荐治疗剂量的5 ～10 倍时，克伦特罗、西马特罗等β-AAs 能促进动物脂肪代谢，并增加蛋白合成，具有明显的“营养再分配”作用［1-3］。因此，多种β-AAs 类化合物先后在养殖中作为促生长剂被大量使用，在我国也被称为“瘦肉精”。然而，由于克伦特罗残留在欧洲多个国家导致了多起食品中毒事故，欧盟、中国等先后禁止β-AAs 物质用作食品动物促生长剂［4，5］。近年来，作为新的“瘦肉精”替代品，β-AAs 类化合物氯丙那林（CLO）也被发现非法添加于饲料中［6］。同时，还出现了兽药制剂中添加氯丙那林的违法事件。为了保障动物源食品安全，农业部1519 号公告已经禁止盐酸氯丙那林等在饲料和动物饮水中使用［7］。

在分子结构上，β-AAs 类化合物一般具有苯乙醇胺（phenylethanolamine，PEA）母核以及不同的N-取代基（见图1）。Smith 等［8］的研究表明，苯环取代基类型是决定β-AAs 类化合物代谢特点的关键因素。当PEA 的苯环上有羟基（苯酚型，如莱克多巴胺、沙丁胺醇等）时，动物体内的主要代谢途径是酚羟基的葡萄糖醛酸或硫酸轭合，且轭合代谢产物是体内的主要残留形式。而对于克伦特罗等苯环取代基为氨基（苯胺型）的β-AAs，在动物体内可能发生氧化、轭合代谢，但主要残留形式为未代谢的原形。在检测动物尿液和组织中β-AAs 残留时，一般先对样品进行水解，然后测定游离态β-AAs 原形的总量［9-12］。

氯丙那林分子（结构式见图1a）的苯环上只有一个氯取代基，既不属于苯胺型，也不属于苯酚型。因此，氯丙那林在动物体内的主要代谢途径可能与其他β-AAs 类化合物不同。目前，氯丙那林在猪、牛等家畜体内的代谢研究还是空白，而在一些专门针对氯丙那林的残留分析方法中［13，14］，并未对样品进行酶解，且直接将原形作为检测目标物。在本研究中，将利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC／Q-TOF MS）技术，检测和鉴定猪口服氯丙那林后尿液中的主要代谢产物，研究氯丙那林在猪体内的主要代谢途径。

图1 （a）氯丙那林、（b）克伦特罗和（c）莱克多巴胺的分子结构Fig.1 Structures of （a）clorprenaline，（b）clenbuterol and （c）ractopamine

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪（Waters Acquity UPLC-SYNAPT HDMS，美国Waters公司）；猪代谢笼（北京人和机械厂）；高速离心机（德国Thermo 公司）；涡旋振荡器（MS-3，德国IKA公司）；氯丙那林（含量＞95%，中国食品药品检定研究院）；乙腈（HPLC 级，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（分析纯，北京试剂公司）

1.2 样品采集及处理

长白猪（购自北京市苏家坨养殖场），体重30 ～40 kg。代谢实验前，动物在代谢笼中适应一周，饲喂空白饲料，自由饮水。给药前禁食12 h，不禁水。按10 mg／kg （b. w.）的剂量，口服给药一次。给药后，自由采食进水。收集给药前12 h 内的尿液，作为空白样品。收集给药后24 h 内的尿液，8 000 r／min 离心10 min，取上清液于-20 ℃冷冻保存。

取以上样品500 μL 于5 mL 塑料离心管中，加入乙腈溶液2.0 mL，充分涡旋振荡后，以5 000 r／min 离心10 min，转移上清液。按照以上方法，重复提取一次。合并上清液，在50 ℃氮气流下浓缩至小于0.5 mL。用水定容至0.5 mL 后，以12 000 r／min 离心10 min，取上清液过0.22 μm 滤膜后，供UPLC／Q-TOF MS 分析。

1.3 UPLC／Q-TOF MS 条件

色谱柱采用ACQUITY HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱 温30 ℃，流 速0.400 mL／min，进样体积2 μL。流动相A 为含0.1% 甲酸的乙腈，流动相B 为含0.1% 甲酸的水溶液，梯度洗脱程序如下：0 ～1.0 min，保持2% A；1.0 ～5.0 min，流动相A 的比例由2% 线性变化至30%；5.0～7.0 min，流动相A 的比例由30% 线性变化至60%；7.0 ～9.0 min，流动相A 的比例保持95%；9.0 ～11.0 min，保持流动相A 的比例为2%。

Q-TOF MS 采用电喷雾正离子源（ESI＋）；毛细管电压3.0 kV；电离源温度120 ℃，锥孔电压20 V，数据采集质量范围为50 ～1 000 Da；数据采集方式为MSE模式，一级质谱（MS）碰撞能量为4 eV，二级质谱（MS／MS）碰撞能量为10 ～30 eV。检测前，采用甲酸钠溶液进行精确质量校正，并用亮氨酸-脑啡肽溶液（［M＋H］＋，m／z 556.277 1 Da）进行实时质量锁定。

1.4 代谢物检测和结构鉴定

采用MetaboLynx XS 软件对UPLC／Q-TOF MS 采集的数据进行处理。首先，对数据进行质量亏损过滤（MDF）处理，消除内源性代谢物的干扰。在MDF 处理时，以氯丙那林（C11H17NOCl，［M ＋H］＋＝214.099 9 Da）为模板（template），MDF 的阈值为±50 mDa。然后，根据氯丙那林可能代谢途径的精确质量变化，进行离子色谱峰提取（EIC），筛查可能的代谢产物。其中，在EIC 处理中，保留时间和精确质量的误差分别为±0.05 min 和±10 mDa。最后，根据MSE采集的MS／MS 信息，对比代谢产物和原形的主要碎片离子，对代谢产物的结构进行鉴定。

1.5 相对含量计算

由于无法得到所有代谢物的对照品，因此，只能根据EIC 的峰面积估算氯丙那林原形或代谢物的相对含量。具体计算公式如下：氯丙那林或代谢物相对含量＝峰面积CLO或代谢物／（峰面积CLO＋峰面积CLO_M1＋……＋峰面积CLO_M9）×100%。

2 结果与讨论

2.1 氯丙那林的质谱裂解特征

根据UPLC／Q-TOF MS 采集的MS／MS 信息（见图2），氯丙那林的准分子离子（［M＋H］＋）可以产生4 个主要的碎片离子，分别为m／z 196、m／z 154、m／z 118 和m／z 91，其元素组成、精确质量数（exact mass，EM）和不饱和度（double bond equivalent，DBE）分别见表1。

图2 氯丙那林的MS／MS 图Fig.2 MS／MS spectrum of clorprenaline

表1 氯丙那林的［M＋H］＋及其主要碎片离子的元素组成、EM 理论值及测量值、不饱和度（DBEs）和质量偏差Table 1 Element compositions，exact masses，DBEs and mass errors of［M＋H］＋and fragment ions of clorprenaline

图3 氯丙那林的质谱碎裂途径Fig.3 Proposed fragmentation pathways of clorprenaline

2.2 代谢产物鉴定

除氯丙那林原型外，在猪尿液中还检测到9 种主要代谢产物，其中，Ⅰ相代谢产物2 种，Ⅱ相代谢产物7 种。氯丙那林及其代谢产物的UPLC 保留时间（RT）、精确质量数、元素组成和相对含量等见表2。另外，9 种代谢产物（CLO_M1 ～ CLO_M9）的EICs 谱图和MS／MS 谱图分别见图4 和图5。

表2 猪尿样品中氯丙那林及其代谢产物的色谱-质谱信息、代谢途径和相对含量Table 2 LC-MS information，biotransformation pathways and relative contents of clorprenaline and its metabolites in swine urine

图4 猪尿中氯丙那林代谢产物（CLO_M1 ～CLO_M9）的EIC 图Fig.4 EICs of clorprenaline metabolites （CLO_M1-CLO_M9）in swine urine

2.2.1 Ⅰ相代谢产物

代谢物CLO_M1（m／z 230.094 5，RT ＝3.66 min）与CLO_M2（m／z 230.095 6，RT ＝4.09 min）的［M＋H］＋的元素组成都为C11H17NO2Cl（EM 理论值为230.094 8 Da），比氯丙那林（C11H17NOCl）多一个氧原子。MS／MS 图（图5）显示，M1 和M2 具有相同的碎片离子m／z 212、m／z 170 和m／z 134，比氯丙那林的特征碎片离子m／z 196、m／z 154 和m／z 118 大16 Da，说明CLO_M1 和CLO_M2 是氯丙那林的氧化产物。另外，碎片离子m／z 170（C8H9NOCl）和m／z 134（C8H8NO）的存在，说明氧化代谢反应发生在苯环上，而不是侧链的N-异丙基上。因此，CLO_M1 和CLO_M2 被确定为氯丙那林的苯环羟基化代谢产物（OH-CLO），可能的质谱裂解途径见图6。

图5 氯丙那林代谢产物（CLO_M1 ～CLO_M9）的MS／MS 图Fig.5 MS／MS spectra of clorprenaline metabolites （CLO_M1-CLO_M9）

2.2.2 Ⅱ相代谢产物

代谢物CLO_M3（m／z 390.131 2，RT ＝4.05 min）和CLO_M4（m／z 390.130 5，RT ＝4.24 min）的［M＋H］＋的元素组成为C17H25NO7Cl（EM 理论值为390.132 0 Da），比氯丙那林多C6H8O6（EM 理论值为176.032 1 Da）。同时，CLO_M3 和CLO_M4都具有与氯丙那林相同的特征碎片离子m／z 196和m／z 154（见图5），因此，可以确定它们为氯丙那林的葡萄糖醛酸轭合产物（GLU-CLO），可能的轭合反应位点为β-羟基或脂肪仲胺。

图6 OH-CLO 可能的质谱裂解过程Fig.6 Proposed fragmentation pathways of OH-CLO

代谢物CLO_M5（m／z 406.126 4，RT ＝2.71 min）、CLO_M6（m／z 406.127 1，RT ＝2.75 min）、CLO_M7（m／z 406.124 8，RT ＝3.35 min）和CLO_M8（m／z 406.127 1，RT ＝3.41 min）的［M＋H］＋的元素组成全部为C17H25NO8Cl（EM 理论值为406.126 9 Da），比OH-CLO（CLO_M1 和CLO_M2）多C6H8O6（EM 理论值为176.032 1 Da）。同时，它们都具有与OH-CLO（CLO_M1 和CLO_M2）相同的特征碎片离子m／z 212 和m／z 170（见图5）。因此，CLO_M5、CLO_M6、CLO_M7 和CLO_M8 是OH-CLO 的4 种葡萄糖醛酸轭合物（GLU-OHCLO）。

在OH-CLO 分子中，β-羟基、脂肪仲胺或酚羟基都可能与葡萄糖醛酸轭合。有研究［8］表明，对于苯环上有羟基的β-AAs 化合物（如莱克多巴胺等），酚羟基比β-羟基和仲氨基更容易与葡萄糖醛酸发生轭合反应。从图4 可以看出，CLO_M8 的质谱响应明显大于其他GLU-OH-CLO 的同分异构体。因此，可以推测CLO_M8 的轭合位点可能在苯环上的羟基上。然而，只根据质谱所采集的碎片离子信息，还无法准确确定轭合反应发生的具体位置。

代谢物CLO_M9（m／z 310.052 0，RT ＝3.34 min）的［M＋H］＋对应的元素组成为C11H17NSO5Cl（EM 理论值为310.051 6 Da），比OH-CLO（CLO_M1 和CLO_M2）多SO3（EM 理论值79.956 8 Da）。同时，CLO_M9 可以失去SO3生成碎片离子m／z 230（C11H17NO2Cl），并具有与OH-CLO 相同的特征碎片离子m／z 212 和m／z 170（图5）。因此，可以确定CLO_M9 为OH-CLO 的硫酸轭合产物（SO3-OH-CLO）。另外，在尿液中没有发现氯丙那林的硫酸轭合产物（C11H17NSO4Cl，［M＋H］＋＝294.056 7 Da），说明β-羟基和脂肪仲胺不易与硫酸轭合。由此可以推测，CLO_M9 的硫酸轭合位点在苯环羟基化引入的酚羟基上。

2.3 氯丙那林在猪体内的主要代谢途径

在本研究中，利用UPLC／Q-TOF MS 在猪尿中检测和鉴定了氯丙那林的2 种Ⅰ相代谢产物和7 种Ⅱ相代谢产物。根据代谢物鉴定结果，推测氯丙那林在猪体内先发生苯环羟基化和葡萄糖醛酸轭合，而羟基化氯丙那林（OH-CLO）还能继续与葡萄糖醛酸和硫酸轭合（见图7）。

图7 氯丙那林在猪体内的主要代谢途径Fig.7 Proposed metabolic pathways of clorprenaline in swine

本研究的结果表明，与其他β-AAs 化合物相似，氯丙那林在猪体内的主要代谢途径也是氧化和轭合反应。以前的研究显示，苯胺型的克伦特罗在牛和猪体内的氧化代谢主要发生在苯胺上［14，15］。然而，由于苯环上的取代基类型不同，氯丙那林的氧化代谢主要是苯环的羟基化。另外，氯丙那林也能通过β-羟基和仲氨基与葡萄糖醛酸轭合，但没有发现其硫酸轭合产物。

氯丙那林的羟基化代谢产物（OH-CLO）含有一个酚羟基，结构特点与苯酚型β-AAs（如莱克多巴胺）相似。本研究发现，OH-CLO 的代谢特征与莱克多巴胺相同［8，16］，可 以生成 葡萄糖 醛酸轭 合物（GLU-OH-CLO）和硫酸轭合产物（SO3-OH-CLO）。另外，OH-CLO 及其轭合物（GLU-OH-CLO 和SO3-OH-CLO）的相对含量为60.9%，明显高于氯丙那林原形及其轭合产物（39.1%）。因此，羟基化及轭合反应是氯丙那林在猪体内的主要代谢途径。

3 结论

本文采用UPLC／Q-TOF MS 鉴定了猪尿中氯丙那林的9 种代谢产物，并推测了氯丙那林在猪体内的主要代谢途径——苯环羟基化、葡萄糖醛酸轭合和硫酸轭合。本研究还发现，羟基化氯丙那林及其轭合物是尿液中的主要代谢产物，这将为确定氯丙那林在动物体内的残留标示物提供科学依据。

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