牛磺酸通过激活PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡

梁栋 刘云峰 章毅 尹建红 许林鑫 杨静

论著

牛磺酸通过激活PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡

梁栋 刘云峰 章毅 尹建红 许林鑫 杨静

目的 探讨牛磺酸对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响及其信号途径。方法 取健康产妇分娩后12 h内的脐带分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC），进行细胞培养并分为5组：正常葡萄糖组（5 mmol/LD-葡萄糖，NG组）；高糖组（30 mmol/LD-葡萄糖，HG组）；NG+TAU组（5 mmol/LD-葡萄糖 +5 mmol/L牛磺酸）；HG+TAU组（30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸）；HG+TAU+Wo组（30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸+50 nmol/Lwortmannin）。干预48 h后应用流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western印迹检测磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表达水平，2，7-二氯二氢荧光素二乙酯（H2DCF-DA）探针技术及荧光倒置显微镜检测活性氧簇的相对含量。结果 与NG组相比，HG组细胞的凋亡率显著增加（P＜0.05）。与HG组相比，HG+TAU组的凋亡率下降（P＜0.05）。与HG+TAU组相比，HG+TAU+Wo组的凋亡率较高（P＜0.05）。与NG组相比，HG组磷酸化-Akt蛋白表达下降（P＜0.05）。与HG组比较，HG+TAU组磷酸化-Akt蛋白表达增加（P＜0.05）。与HG+TAU组相比，HG+TAU+Wo组磷酸化-Akt蛋白表达下降（P＜0.05）。牛磺酸可降低高糖诱导的活性氧簇生成（P＜0.05），这一作用亦可被wortmannine所阻断（P＜0.05）。结论 牛磺酸通过PI3K/Akt信号途径调节细胞内活性氧簇生成，进而在高糖环境下发挥其抗凋亡作用。

牛磺酸；内皮细胞；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；细胞凋亡

2型糖尿病发病率显著增加并逐渐成为一个公共健康问题，给社会经济发展带来沉重负担[1]。高血糖是糖尿病血管病变的高危因素，而后者是糖尿病患者的主要死因[2]。内皮细胞功能受损及活性下降在很大程度上导致动脉粥样硬化斑块的形成。研究证实，高糖诱导的内皮细胞凋亡与升高的活性氧簇含量及随后的多重信号系统的激活密切相关[3-4]。牛磺酸是一种含硫半必需氨基酸，参与多种生理功能的调节，有助于预防糖尿病、肥胖、脂代谢紊乱和高血压的发生。研究报道，牛磺酸作为一种内源性的抗氧化剂，通过一系列机制保护细胞（包括抗氧化、调节离子转运、渗透压等）。另有报道表明牛磺酸能够预防高糖诱导的内皮细胞凋亡，并且与削弱内皮细胞内活性氧簇形成相关，但其详细的信号机制尚不明确[5-6]。有学者提出，牛磺酸可通过调节细胞内蛋白激酶B（Akt/PKB）的磷酸化水平减少细胞内活性氧簇的生成[7-8]。本研究拟进一步证实在内皮细胞内，牛磺酸是否经由调节细胞内Akt/PKB磷酸化水平而发挥其抗凋亡作用。

1 材料和方法

1.1 材料 牛磺酸购自Sigma公司。AnnexinV-FITC凋亡试剂盒购自BD公司。活性氧簇检测试剂4，5-二氨基荧光素二乙酸酯（DAF-2DA）购自Cayman公司。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特异性阻断剂wortmannin购自Calbiochem公司。磷酸化-Akt（Ser473）抗体为Cell Signaling Technology公司产品。Actin抗体购自NeoMarker公司。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离培养取山西医科大学第一医院产科健康产妇分娩后12 h内的脐带，依据文献的方法分离HUVEC[9]。采用M199培养基，其中含10%FBS，青霉素100 IU/ml，链霉素0.1 μg/L，肝素 0.1 g/L，ECGS 75 mg/L。细胞在 37℃、5%CO2条件下培养，当细胞密度达70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化传代。

1.2.2 实验分组及干预 实验分组如下：正常葡萄糖组（5 mmol/LD-葡萄糖，NG组）；高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖，HG组）；NG+TAU组（5 mmol/LD-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸）；HG+TAU组（30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸）；HG+TAU+Wo组（30 mmol/L D-葡萄糖+5mmol/L牛磺酸+50nmol/Lwortmannin）；培养板中细胞融合至80%时用含1%FBS的M199培养基过夜同步。之后，各组不同因素干预48 h。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 HUVEC接种于6孔板，细胞同步后加上述不同因素处理，每组设3个复孔，培养48 h后弃培养液，胰酶消化后收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，annexin-Ⅴ/PI双染试剂盒染色，流式细胞仪定量分析。早期细胞凋亡率=早期凋亡细胞数/所测细胞总数×100%，实验重复3次。

1.2.4 活性氧簇生成检测 35 mm培养皿中细胞分组及干预同前。之后在正常葡萄糖浓度无酚红培养液中，37℃细胞负载2，7-二氯二氢荧光素二乙酯（H2DCF-DA，5 μmol/L）30 min。PBS冲洗 3 次，避光。加入预热的无酚红培养基。荧光倒置显微镜观察并摄片。ISO200，曝光时间1/4.5s，亮度、对比度固定。每样品随机选取4个视野，绿色荧光强度平均积分光密度使用Image Pro图像分析软件定量分析，实验重复3次。

1.2.5 Western印迹分析 35 mm细胞培养板中细胞分组及干预同前。加入100 μl细胞裂解液裂解5min。收集细胞裂解液至1.5mlEP管中（4℃）。超声3×5s，沸水中煮沸5min。10000r/min 离心（r=165mm）5min。BCA法检测总蛋白含量。每样品取30 μg，加等体积2×SDS上样缓冲液，混匀，上样。进行SDS-PAGE分离蛋白（分离胶浓度10%）。之后转至PVDF膜。室温下，5%脱脂奶封闭液封闭1 h。1∶1 000的兔抗人磷酸化-Akt（Ser473）抗体 4℃过夜孵育。之后，1∶2 000的HRP-标记的羊抗兔抗体室温下孵育1h。ECL试剂盒孵育2min，X光片感光，显影。应用Image J图像处理系统对胶片进行扫描测量感光区带的感光密度，并进行积分处理，β-actin作为内参，实验重复3次，计算相对含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计学分析软件，正态分布的计量资料以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，检验水准：α=0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牛磺酸对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响 与NG组相比，HG组细胞的凋亡率显著增加（P＜0.05）；与HG组相比，HG+TAU组的凋亡率下降（P＜0.05）；与HG+TAU组相比，HG+TAU+Wo组的凋亡率较高（P＜0.05）。见图1，表1。

2.2 牛磺酸对高糖诱导的HUVEC磷酸化-Akt蛋白表达的影响 与NG组相比，HG组磷酸化-Akt蛋白表达下降（P＜0.05）；与HG组比较，HG+TAU组的磷酸化-Akt蛋白表达增加（P＜0.05）；与 HG+TAU组相比，HG+TAU+Wo组的磷酸化-Akt蛋白表达下降（P＜0.05），见图2。

图1 不同组别HUVEC的凋亡率比较

表1 不同组别HUVEC的凋亡率（±s，%）

表1 不同组别HUVEC的凋亡率（±s，%）

注：与 NG组相比，aP＜0.05；与 HG组相比，bP＜0.05；与HG+TAU组相比，cP＜0.05；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；NG组：正常葡萄糖组；HG组：高糖组；NG+TAU组：正常葡萄糖+牛磺酸组；HG+TAU组：高糖+牛磺酸组；HG+TAU+Wo组：高糖+牛磺酸+wortmannin组

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图2 牛磺酸对高糖诱导的HUVEC磷酸化-Akt蛋白表达的影响

2.3 牛磺酸对高糖诱导的HUVEC活性氧簇生成的影响 与NG组相比，HG组活性氧簇生成增加（P＜0.05）；与HG组相比，HG+TAU组的活性氧簇生成下降（P＜0.05）；与HG+TAU组相比，HG+TAU+Wo组的活性氧簇生成增加（P＜0.05），见表3。

表3 各组活性氧簇荧光强度平均积分光密度（±s）

表3 各组活性氧簇荧光强度平均积分光密度（±s）

注：与 NG组相比，aP＜0.05；与 HG组比，bP＜0.05；与 HG+TAU组相比，cP＜0.05；NG组：正常葡萄糖组；HG组：高糖组；NG+TAU组：正常葡萄糖+牛磺酸组；HG+TAU组：高糖+牛磺酸组；HG+TAU+Wo组：高糖+牛磺酸+wortmannin组

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3 讨论

血管内皮细胞作为一个重要的自分泌和旁分泌器官，通过调节血管张力，局部细胞生长和细胞外基质沉积而维持血管内环境稳定。内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化过程的起始步骤，也是启动糖尿病大血管病变的重要环节[6]。糖尿病患者内皮细胞功能障碍的主要特征为细胞增殖、屏障功能、循环细胞黏附能力的改变及凋亡的发生[10-11]。牛磺酸不仅参与维持机体内环境的稳态，而且对多种组织细胞有明显的保护作用。研究显示，口服牛磺酸能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病模型鼠主动脉内皮依赖的舒张功能。牛磺酸能显著改善1型糖尿病模型鼠左室收缩及舒张功能，并伴随Akt/PKB信号通路活性及超氧化物歧化酶、血红素加氧酶-1蛋白水平的持续升高[7]。进一步研究显示，牛磺酸能预防高糖诱导的内皮细胞凋亡，其抗凋亡效应与降低细胞内活性氧簇和稳定细胞内钙水平相关[5]。在内皮细胞，Akt活化可激活内皮型一氧化氮合酶，减少细胞内活性氧簇的生成，发挥抗凋亡作用。还有学者证实，细胞内钙离子过多或细胞外钙离子流入胞内过多均可损伤细胞，而牛磺酸可调节细胞内、外钙离子流动，发挥细胞保护作用[12]。但牛磺酸是否可通过减少活性氧簇及Akt生成而发挥抗凋亡作用，目前尚无定论。

本研究以HUVEC为研究对象，结果显示，高糖诱导的内皮细胞凋亡率显著高于NG组。与HG组相比，经过牛磺酸处理的内皮细胞凋亡率显著下降，说明牛磺酸对血管内皮具有一定的保护作用。细胞中的Akt在无外来因素刺激时处于去磷酸化状态，只有磷酸化-Akt才具有生物学特性，而高糖诱导内皮细胞凋亡可能与丝裂原活化蛋白激酶信号途径的激活及Akt磷酸化活性的减弱有关[13-14]。本研究显示，高糖可下调HUVEC中磷酸化-Akt蛋白的表达水平，而牛磺酸可显著增加高糖环境下磷酸化-Akt蛋白的表达，提示牛磺酸可能通过此途径发挥抗凋亡作用。

活性氧簇是一种重要的细胞内信使和氧化还原反应调节剂，研究发现在心血管疾病及神经退行性疾病患者的细胞内有过量的活性氧簇，当活性氧簇产生过量或机体自身抗氧化能力被削弱时，将导致氧化应激反应的发生。活性氧簇可能是糖尿病并发症的元凶[15]。本研究观察到与HG组相比，HG+TAU组活性氧簇的表达量显著降低，提示牛磺酸可通过下调活性氧簇含量，减少氧化应激反应而保护血管内皮细胞。Wortmannin通过与 PI3K的催化亚单位p110结合，抑制PI3K活性，从而阻断PI3K/Akt信号通路。本研究中，HG+TAU+Wo组细胞内磷酸化-Akt的表达显著下降，而活性氧簇含量显著增加，说明牛磺酸可能经由PI3K/Akt信号途径调节细胞内活性氧簇生成，进而在高糖环境下发挥其抗凋亡作用。综上所述，防止血管内皮功能障碍对预防糖尿病血管病变的发生、改善糖尿病患者生活质量至关重要，而牛磺酸在保护血管内皮并预防糖尿病方面的作用应受到越来越多关注。

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Taurine inhibits endothelial cell apoptosis induced by high glucose through activating PI3K/Akt pathway

Liang Dong*，Liu Yunfeng，Zhang Yi，Yin Jianhong，Xu Linxin，Yang Jing.*Department of Endocrinology，The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Yang Jing，Email：yangjlm@126.com

ObjectiveTo observe the effects and signalling pathway of taurine on high glucose induced endothelial apoptosis.MethodsThe umbilical cord from the healthy puerperal woman delivered in 12 hours was taken and the human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were isolated.HUVECs were cultured and divided into 5 groups：normal glucose group（5 mmol/L D-glucose,NG group），high glucose group（30 mmol/L D-glucose，HG group），NG+TAU group（5 mmol/L D-glucose+5 mmol/L taurine），HG+TAU group（30mmol/LD-glucose+5mmol/Ltaurine），HG+TAU+Wogroup（30 mmol/LD-glucose+5 mmol/Ltaurine+50 nmol/Lwortmannin）.After 48 hours，the apoptosis was tested byFlowCytometryand expressionofphosphorylated-protein kinase B（p-Akt）was examined by Western blot.At the same time，the relative content of reactive oxygen species（ROS） was tested by 2'-7'-Dichlorofluorescein diacetate（H2DCF-DA） probe technique and fluorescent inverted microscope.ResultsCompared with NG group，apoptosis rates in HG group were markedly enhanced（P＜0.05）.Compared with HG group，the apoptosis rates in HG+TAU group were decreased（P＜0.05）.Compared with HG+TAU group，apoptosis rates in HG+TAU+Wo group were increased（P＜0.05）.Compared with HG group，expression of p-Akt protein in NG+TAU group was increased（P＜0.05）.Compared with HG+TAU group，expression of p-Akt protein was reduced in HG+TAU+Wo group（P＜0.05）.Taurine could decrease the production of ROS induced by hyperglycemia（P＜0.05），and the effects were blocked by wortmannin（P＜0.05）.ConclusionsTaurine can regulate the generation of intracellular ROS by PI3K/Akt pathway，then prevent apoptosis of endothelial cell induced byhigh glucose.

Taurine；Endothelial cells；Phosphatidylinositol 3-kinase；Potein kinase B；Apoptosis

（Int J Endocrinol Metab，2015，35：73-76）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.02.001

国家自然科学基金资助项目（81373464，812708822）；山西省自然科学基金资助项目（2013011047-3,2012011039-8）；山西省卫生厅科研课题（201201062）；山西省回国留学人员科研资助项目（2013-111）；山西省留学人员择优启动项目（2011-762,2013-68）；中华医学会临床医学科研专项资金资助项目（13040440429）

030001 太原，山西医科大学第一医院内分泌科（梁栋，刘云峰，尹建红，许林鑫，杨静）；030001 太原，山西医科大学基础医学院药理教研室（章毅）

杨静，Email：yangjlm@126.com

2014-11-11）