海洋分离芽胞杆菌抗白念珠菌活性物质的理化性质及类别

刘全永， 杨 铭， 王书锦

(1.商丘职业技术学院，河南 商丘 476005；2.中国科学院 沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016)



海洋分离芽胞杆菌抗白念珠菌活性物质的理化性质及类别

刘全永1,2， 杨 铭1， 王书锦2

(1.商丘职业技术学院，河南 商丘 476005；2.中国科学院 沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016)

为寻找新型抗真菌活性物质，采用管碟法对7株分离自海洋的芽胞杆菌在不同NaCl浓度下产生抗白念珠菌活性物质特性、活性物质的耐热性及不同pH值条件下的活性进行了比较，八大溶剂系统纸层析法对活性物质的类别进行了初步鉴定。结果表明，随着NaCl浓度的变化产生活性物质的量也在变化，NaCl浓度达7%时均不能产生，但在正常海洋环境盐浓度(NaCl含量2%～3%)下都产生；活性物质有很强的耐热性和耐酸碱性，说明其较稳定；7株菌产生的抗白念珠菌活性物质均为碱性水溶性抗生素。由于目前临床上抑制人体病原真菌活性物质绝大多数为脂溶性，因而这些芽胞杆菌产生的抗白念珠活性物质有可能为新型物质，此外本研究结果为这些菌株所产生活性物质的分离纯化提供了依据。

海洋芽胞杆菌；白念珠菌；抗真菌；生物活性物质

寻找新型抗真菌活性物质一直是研究热点[1-11]。海洋细菌可以产生多种不同作用的生物活性物质[12-23]，但对于其抗白念珠菌(Candidaalbicans)的报道却很少见。从我国近海海域不同地区采集的海水样品中，筛选到了7株对白念珠菌有较强抗性的芽胞杆菌[23]，将其中1株定名为凝结芽胞杆菌黑石礁亚种(Bacilluscoagulanssubsp.heishijiaosis)[24]。由于从自然界中筛选的野生微生物菌株产生活性物质的量往往很低，且发酵液中杂质含量很高，要将活性物质从中分离出来，往往需要酸碱沉淀除杂、加热浓缩、溶媒萃取等多种预处理，这要求活性物质具有较强的稳定性；此外，活性物质的水溶性强弱及离子特性对于采用何种分离提取手段起到重要的参考作用，因而理化性质的研究是新型活性物质筛选过程中关键的步骤[26]。鉴于目前已知的抗真菌天然产物均为脂溶性的特点，通过理化性质特别其溶媒萃取特征及其八大层析系统图谱特征可以判断活性物质的大致类别，并为活性物质的进一步分离纯化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供试菌株为本试验室自行分离筛选得到的7株抗白念珠菌活性较强的芽胞杆菌，分别编号为LU-B13(分自于三亚南天一柱海水样品)；LU-B35(分自于三亚大东海水样1)；LU-421、LU-4B1和LU-4B2(分自于三亚大东海水样2)；LU-101(分自于青岛栈桥水样)、LU-B02(分自于大连黑石礁水样)。LU-B02为凝结芽胞杆菌，LU-B13属蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，其余各菌株为短小芽胞杆菌(Bacilliuspumilus)，靶子菌为白念珠菌(Candidaalbicans)，由吉林大学医学院提供。

1.1.2 培养基 LU-B35、LU-421、LU-4B1、LU-4B2、LU-101活性物质发酵培养基为抗白念珠菌1号培养基(葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，NaCl 1%，水100 mL，0.8 Pa灭菌20 min)；LU-B13、LU-B02活性物质发酵培养基为抗白念珠菌2号培养基(葡萄糖2 g，蛋白胨0.3 g，酵母膏0.8 g，水100 mL，0.8 Pa灭菌20 min)，靶子菌培养基为沙氏培养基。

1.2 方法

1.2.1 海洋分离芽胞杆菌活性物质耐盐性的比较 配制NaCl浓度为0、1%、3%、5%、7%的抗白念珠菌1号液体培养基和抗白念珠菌2号液体培养基(20 mL/150 mL)，将各试验菌种按5%的接种量分别接入摇瓶，28 ℃振荡培养24 h(其中LU-B35培养32 h)，3 500 r/min离心去沉淀，沙氏平板上管碟法测定发酵液对白念珠菌的抑菌活性。

1.2.2 海洋分离芽胞杆菌活性物质的耐热性 配制抗白念珠菌1号液体培养基和抗白念珠菌2号液体培养基(20 mL/150 mL)，将各试验菌种按5%的接种量分别接入摇瓶，28 ℃振荡培养24 h(其中LU-B35培养32 h)，3 500 r/min离心去沉淀，发酵液分别经水浴70 ℃处理30 min或121 ℃处理20 min后，于沙氏平板上管碟法测定发酵液对白念珠菌的抑菌活性。

1.2.3 海洋分离芽胞杆菌活性物质的耐酸碱性 配制抗白念珠菌1号液体培养基和抗白念珠菌2号液体培养基(20 mL/150 mL)，将各试验菌种按5%的接种量分别接入摇瓶，28 ℃振荡培养24 h(其中LU-B35培养32 h)，3 500 r/min离心去沉淀，发酵液分别以HCl和NaOH调pH至2、4、6、8、10、12，于沙氏平板上管碟法测定发酵液对白念珠菌的抑菌活性。

1.2.4 海洋分离芽胞杆菌活性物质的溶媒萃取特征 配制抗白念珠菌1号液体培养基和抗白念珠菌2号液体培养基(20 mL/150 mL)，将各试验菌种按5%的接种量分别接入摇瓶，28 ℃振荡培养24 h(其中LU-B35培养32 h)，3 500 r/min离心去沉淀，发酵液依次以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，于沙氏平板上管碟法测定水相及各有机溶媒相对白念珠菌的抑菌活性。

1.2.5 海洋分离芽胞杆菌活性物质的八大溶剂系统纸层析[26]配制抗白念珠菌1号液体培养基和抗白念珠菌2号液体培养基(20 mL/150 mL)，将各试验菌种按5%的接种量分别接入摇瓶，28 ℃振荡培养24 h(其中LU-B35培养32 h)。3 500 r/min离心去沉淀，上清液用毛细玻璃管于16 cm×2 cm的滤纸条上点样3次，于八大溶剂系统中进行层析。待溶剂上升至终点取出滤纸条，晾干后贴于涂有白念珠菌的沙氏培养基上20 min，使活性物质转移到培养基表面，28 ℃下培养过夜，观察记录抑菌部位，计算Rf值。

2 结果与分析

2.1 海洋分离芽胞杆菌不同盐浓度下发酵产生活性物质

海洋细菌产生次级代谢产物的能力往往与培养基中NaCl含量有关。图1显示7株芽胞杆菌在不同NaCl浓度的培养基中产生抗真菌活性物质的情况，从总体上看，在不含NaCl的培养基中均能很好地产生活性物质，在NaCl浓度为7%时皆不能产生抗真菌活性物质。同时NaCl浓度对7株菌产生活性物质的影响程度存在着一定的差异， 3% NaCl浓度下，除LU-101外，其他6株菌均能产生活性物质；5% NaCl浓度下，只有LU-B35和LU-B02能产生活性物质。说明NaCl浓度对LU-101的影响最为明显，当NaCl浓度仅为1%时没有活性；对NaCl浓度最不敏感的是LU-B35和LU-B02，它们在NaCl浓度5%以下时均能较好产生活性物质。由于海水NaCl浓度2%～3%，因而除LU-101外，其余6株菌在海水环境盐浓度下培养均保持一定的抗真菌活性。

图1 海洋分离芽胞杆菌活性物质的耐盐性Fig.1 Salinity tolerance of bioactive substances by marine-derived bacilli

2.2 海洋分离芽胞杆菌活性物质的耐热性

7株芽胞杆菌产生的抗白念珠菌活性物质的热稳定性如图2所示。7株菌产生的活性物质经70 ℃处理30 min或121 ℃处理20 min后与处理前比较，活性均可保持原有活性约90%以上，说明它们产生的活性物质分子结构及抗真菌活性在高温下稳定。

图2 海洋分离芽胞杆菌活性物质耐热性Fig.2 Heat stability of bioactive substances of marine-derived bacillii

2.3 海洋分离芽胞杆菌活性物质的耐酸碱性

7株芽胞杆菌产生的抗白念珠菌活性物质的耐酸碱性如图3所示。7株菌产生的抗真菌活性物质在pH 2～12的条件下均显示出较强的活性，即具有较强的耐酸碱性，但也表现出一定的差异。LU-B13、LU-4B1、LU-4B2、LU-B02产生的活性物质活性在不同pH值下最为稳定，经酸碱处理后，活性略有上升或不变；LU-B35、LU-421、LU-101产生的活性物质在酸性条件下比碱性条件下更为稳定，LU-421在pH 12时活性损失较明显。

图3 海洋分离芽胞杆菌抗真菌活性物质的耐酸碱性Fig.3 Marine-derived bacilli bio-active substances pH stability

2.4 海洋分离芽胞杆菌活性物质的溶媒萃取特征

各菌株产生的活性物质依次经氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶媒萃取后，各相抗白念珠菌活性如图4所示。从总体上看，7株海洋芽胞杆菌产生的抗真菌活性物质均具有强极性组分存在，其中LU-4B1和LU-4B2的氯仿萃取液均显示一定的活性，LU-B13活性物质只存在于水相，表明LU-B13产生的活性物质极性最强，其余几株菌的活性物质还存在于正丁醇相，LU-B35、LU-101产生的抗真菌活性物质在正丁醇相和水相的活性基本相同。

图4 有机溶媒萃取后各相活性Fig.4 Bio-activity of substances in each

2.5 海洋分离芽胞杆菌活性物质的初步鉴定结果分析

由于各类抗生素的酸碱性、极性和溶解度的不同，根据它们在八大溶剂系统中呈现出来的Rf值绘制的曲线图谱，可将它们归属为6个大类，分别为碱性水溶性抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、多烯类抗生素、非水溶性I型抗生素、非水溶性II型抗生素。

各菌株产生的活性物质经八大溶剂系统纸层析后，Rf值曲线如图5所示。可以看出，7株海洋芽胞杆菌产生的活性物质在溶剂系统5和6中的Rf值明显较大。在溶剂系统5中的Rf值界于0.99～1.0之间，在溶剂系统6中的Rf值界于0.85～0.98之间；在其他溶剂系统中移动较小，尤其是在溶剂系统7中全部不移动，在溶剂系统1中移动的Rf值界于0.06～0.22之间 。与抗生素八大溶剂系统标准层析图谱相比，它们均属碱性水溶性类抗生素，这与其有机溶媒萃取特征相一致。此外，在溶剂系统4中所有菌株产生的活性物质均不显迹，可能是由于该溶剂系统所含六氢吡啶对活性物质造成活性焠灭的缘故。试验表明，所有7株海洋芽胞杆菌产生的活性物质经八大溶剂系统层析并显迹后都只有一个显样点出现，说明其主要活性物质组分为单一组份或结构性质相近的碱性水溶性物质，LU-4B1和LU-4B2产生的活性物质中非水溶性组分未出现显迹，可能是由于其所占比例过低，且点样量小所造成的。

图5 八大溶剂系统层析图谱Fig.5 Paper chromatography of bioactive substances

3 讨 论

前期对7株抗白念珠菌的海洋芽胞杆菌的生理生化特征研究已知，除LU-B02外，其他6株菌耐盐度达10%以上。本研究结果表明，当NaCl浓度达7%时，它们均不能产生抗真菌活性物质，说明随着海水中盐度的变化，这些菌产生活性物质的特性也在发生变化，但在正常的海洋环境中(NaCl含量2%～3%)，都有产生抗白念珠菌活性的能力。此外，虽然这7株菌最高生长温度都在50 ℃以下，但它们产生的活性物质却表现出很强的耐热性和耐酸碱性，说明其活性物质的稳定性较强。

目前抗人体病原真菌活性物质绝大多数为脂溶性，只有极少数抗生素如经结构改造后才具有较好的水溶性，寻找水溶性的抗人体病原真菌的天然活性物质是当前抗真菌药物筛选工作的重点之一，八大溶剂系统纸层析结果显示7菌株产生的抗白念珠菌活性均为碱性水溶性抗生素。 此前对7株芽胞杆菌鉴定的结果可知，LU-B02为凝结芽胞杆菌黑石礁亚种(Candidacoagulanssubsp.heishijiaosis)，而迄今尚无该菌抗白念珠菌等人体病原真菌的报道，因而由LU-B02产生的碱性水溶性活性物质很可能是一种新型活性产物，这有待于进一步研究证实。

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Physico-Chemical Characters & Classification of Anti-Candida Bioactive Substances Produced by 7 Marine-DerivedBacillusStrains

LIU Quan-yong1, 2, YANG Ming1, WANG Shu-jin2

(1.ShangqiuVocat'l&Tech.Inst.,Shangqiu476005; 2.ShenyangInst.ofAppl.Ecol.,CAS,Shenyang110016)

In order to search for new type of anti-fungal bioactive substances, method of tube plate was adopted to compare the features of 7 marine-isolatedBacillusstrains producing anti-candida bioactive substances at different NaCl concentrations and their thermal resistance and under the condition of different pH value activity. Eight major solvent system of paper chromatography to initially identify the category of active substances was carried out. The result showed that with the variation of NaCl concentration the amount of the bioactive substances produced by theBacillusstrains also varied, all theBacillusstrains cannot produce anti-candida substances when NaCl was as high as 7%, however, they all could produce bioactive substances under normal sea circumstances saline concentration (NaCl content at 2%～3%); the active substances had strong heat and acid-alkaline resistances, suggesting they are fairly stable. The anti-candida active substances produced by 7 strains were all alkaline and water soluble antibiotics. Due to the current clinically inhibiting human pathogenic fungi active substances mostly are lipid-soluble; therefore, these active substances of anti-candida may have the possibility to be a new type of substance that could resistCandidaalbicans. Moreover, the results of this study had provided a foundation to isolate and purify the production of the active substances by these strains.

marine-isolated bacilli;Candidaalbicans; anti-fungal; bioactive substances

国家科技支撑计划项目(2011BAE06B04-03)

刘全永 男，博士，副教授。主要从事微生物资源与应用研究。Tel：0370-3182188，E-mail: liuqy710@sina.com

2014-11-12；

2015-02-18

Q938.2

A

1005-7021(2015)01-0019-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.004