微生物燃料电池中假单胞菌F026的产电性能研究

费讲驰， 滕 瑶， 熊利芝， 吴玉先， 陈义光， 何则强

(吉首大学 生物资源与环境科学学院, 湖南 吉首 416000)



微生物燃料电池中假单胞菌F026的产电性能研究

费讲驰， 滕 瑶， 熊利芝， 吴玉先， 陈义光， 何则强*

(吉首大学 生物资源与环境科学学院, 湖南 吉首 416000)

基于微生物燃料电池的反应装置，从污水处理厂曝气池的污泥中通过富集，筛选和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析等手段驯化出1株高效产电假单胞菌F026。以F026为阳极产电菌制作微生物燃料电池，考察了底物种类、温度和pH值等因素对微生物燃料电池产电性能的影响。结果表明，F026最适合在以可溶性淀粉为底物，pH为中性偏碱性，温度在30～35 ℃的环境下生长。在此条件下，微生物燃料电池的最高电压达到500 mV，体积功率密度达到2 W/m3。

微生物燃料电池；产电菌；产电性能；假单胞菌

据统计，世界人口已经突破70亿，比19世纪末期增加了2倍多，而能源消费量却增加了16倍多。无论是通过利用太阳能[1]还是节约能源[2]，哪一种常规的能源结构都无法满足人类对能源的需求，人类所面临的能源危机都将日趋严重。因此，新能源的开发与利用成为焦点。近年来，迅速发展起来的一种融合了污水处理和生物产电的新技术——微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell，MFC)受到了广泛关注，其主要技术特点是能够在处理污水的同时获取电能[3-4]。MFC研究初期，主要针对有膜、间接、双池型电池开展微生物和中间筛选等方面的研究，电池输出功率一直较低(小于100 mW/m2)。1999年，Kim等[5]首次发现有些微生物在代谢过程中可将电子直接传递到电极表面。2004年，Jang[6]和Liu等[7]直接以混合菌分别成功构建了无中间体无质子交换膜MFC，电池输出功率达到了526 mW/m2，立即引起更多人对MFC的关注，也引发了以混合菌接种MFC的研究热潮[8]。近几年，随着直接将电子传递给固体电子受体的纯培养菌种的发现，科学家发明了无需使用电子传递中间体的微生物电池，其中所使用的菌种可以将电子直接传递给电极而产生持续高效稳定的电流。特别是美国科学家Bruce Logan的同步废水处理和微生物发电的研究，给MFC的研究注入新的活力，引起了世界各国科学家的高度关注[9]，我国也有相关的研究报道[10]，但针对MFC工艺设计及运行条件优化等研究仍需深入。本研究自湖南省吉首市大田湾污水处理厂曝气池的污泥中筛选出一批高效产电微生物[11]，并在优势菌属中选择假单胞菌F026作为微生物燃料电池的阳极产电菌，对影响微生物燃料电池产电性能的因素进行了研究，得到了优化的产电工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 MFC反应装置的构建 实验装置为自行设计的H型双室微生物燃料电池[12]，如图1所示。该装置由阳极室、阴极室、质子膜组件、硅胶垫圈、紧固螺栓和底座构成，装置阴阳两极室容积均为125 mL，阴阳电极材料均为碳布，有效面积为25 cm2。阴阳极室之间以质子交换膜(Nafion 117，Dupont)隔开，质子交换膜的有效面积为16 cm2。在阳极室和阴极室的圆筒上部分别设有带密封塞的取样孔、曝气孔，并配备电流、电压、温度等在线监测控制装置、曝气装置。质子交换膜使用之前需要依次在30% H2O2、去离子水、0.5 mol/L H2SO4及去离子水中各煮沸1 h，然后保存在去离子水中备用[13]。

电极使用之前的预处理[14]：①切割：将厚度为0.6 cm的碳布切割成5 cm×5 cm；②丙酮清洗：将要使用的碳布浸没在丙酮溶液中，并用玻璃棒将碳布固定于溶液中直到没有气泡产生，丙酮完全进入碳布的毛细管中，24 h后取出，用大量高纯水清洗干净；③干燥恒重：将碳布转入烘箱中105 ℃烘烤2 h，转入干燥器冷却0.5 h，称重。重复上述操作，直至每克碳布质量相差不超过0.000 3 g，最后用密封袋密封转入干燥器中保存以供后续使用。

图1 实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of experimental facility

1：阳极；2：阴极；3：曝气头；4：封盖；5：质子交换膜

1：anode；2：cathode；3：aerator；4：seal-capping；5：PEM

1.1.2 菌株的来源 在图1所示的装置中，将污水处理厂曝气池取来的污泥上清液作为菌源，加入阳极液和阴极液，待其中的菌株进行富集。当电压达到250 mV以上，并持续一段时间保持不变，且具有下降的趋势时，在超净工作台中将阳极室拆开，取出阳极碳布，用无菌水冲洗。然后用梯度稀释法对其中的菌株进行筛选，经过7代纯化后得到52株菌株，进行基于16S rRNA 基因序列的系统发育分析，得到1株高效产电菌F026。该菌株在系统发育树上与已知的高效产电菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[1-16]的自展值为100%，相似度达到97.14%，因此对此菌株进行电化学性能的研究。

1.1.3 试剂与仪器 万用表(UT800，优利德)，pH计，PCR仪(PE29600，BIO-RAD公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)，其他常用试剂及仪器均由邵阳科仪购入。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 在离心管中装入灭菌后的NB培养基，将培养好的纯菌株挑入离心管中进行培养。每个离心管中装有20 mL的NB培养基，挑入纯菌株培养48 h后，9 000 r/min离心10 min去上清液，倒入阳极缓冲溶液20 mL，设定同样的速率和时间进行离心，去上清液后加入适量的阳极缓冲溶液，将菌浓度调至6×1011个 /mL以备后续试验使用。

1.2.2 不同底物及培养液的制备 将阳极装有菌悬液的MFC分别放在5种不同底物中进行实验，观察并记录各种条件下MFC电压数据，考察底物对F026菌株产电性能的影响，得出最适宜F026生长的底物。实验中采用的5种底物分别是乙酸钠、葡萄糖、庶糖、D-木糖和可溶性淀粉。底物质量浓度为8 g/L。阳极室缓冲溶液：12.8 g/L Na2HPO4，3 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH4Cl；阴极电解质溶液：12.8 g/L Na2HPO4，3 g/L KH2PO4，0.01 mol/L K3Fe(CN)6。

1.2.3 温度对MFC产电特性的影响 在15～45 ℃之间分别取20、25、30、35和40 ℃等5个温度点，然后将MFC在不同温度条件下运行，通过观察并记录MFC的产电特性，考察F026最合适的生存温度。

1.2.4 pH对MFC产电特性的影响 由1.2.2和1.2.3筛选出MFC产电量最优的底物和最适宜的温度。在此条件下制成阳极缓冲溶液，并用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 调节pH 值为6、7、8 和9。考察不同酸碱条件下MFC的产电特征，最终判断F026最适宜生存的pH值。

1.2.5 分析方法 每隔60 s通过数据采集系统自动记录电压U值于PC机，通过欧姆定律计算得到电流。计算MFC的体积功率密度P(mW/m3)：

式中，U为数据采集系统记录的电压值(mV)，R为外电路电阻(Ω)，V为阳极室的有效体积(m3)。

2 结果与分析

2.1 不同底物对MFC产电特性的影响

底物对微生物燃料电池产电性能的影响见图2。由图2可知，底物不同，MFC的输出电压及电压维持稳定的时间均不相同。底物为可溶性淀粉时MFC的最高电压可达440 mV；底物为乙酸钠时MFC的最高电压虽然只有260 mV，但其稳定性最强，MFC电压在250 mV上下波动的时间长达40 h；而底物为蔗糖、葡萄糖和D-木糖时MFC的最高电压也分别达到了160、192和158 mV。在所选的5种底物中，启动最快、最为稳定的是乙酸钠溶液，此时MFC的功率密度为540.8 mW/m3。电压最高的是可溶性淀粉，MFC的功率密度达到1 550 mW/m3。

图2 底物对微生物燃料电池产电性能的影响Fig.2 Effect of different substrates on the electricity generation characteristics of MFC

以乙酸钠作为底物的MFC的产电高稳定性与其本身具有的性质有一定关系。乙酸钠是一类弱酸强碱性盐，化学性质较稳定，水解后溶液呈碱性，Puig等[17]指出MFC中阳极碱性基质有利于电能的产生，所以乙酸钠也表现出较高的电压值，并且产生的电压稳定时间较长。可溶性淀粉水解到二糖阶段是麦芽糖，完全水解后得到的是葡萄糖，所以在发生电子转移的过程中能为假单胞菌F026提供充足的能量，且可溶性淀粉水解后具有较强的粘性，保证了更多的菌株富集到碳布电极上，因此MFC表现出了较高的电压值。2012年，Lee等[18]也对铜绿假单胞菌做过相关研究报道，其最大功率密度达到40 mW/m3。

2.2 温度变化对MFC产电特性的影响

温度对微生物燃料电池产电性能的影响见图3。实验采用可溶性淀粉为底物，pH为7。

图3 温度对微生物燃料电池产电性能的影响Fig.3 Effect of different temperatures on the electricity generation characteristics of MF

图4 35 ℃下微生物燃料电池的产电性能Fig.4 The electricity generation characteristic of MFC at 35 ℃

由图3可见，不同温度下MFC的产电性能有明显的差异：在20 ℃和25 ℃时MFC的最高电压分别是315 mV和336 mV，表明尽管温度升高时电压增加不是很大，但却呈现上升趋势，因此需要继续加温，以观察电压的变化。在30 ℃时，电压出现了一个比较大的涨幅，最高电压达到432 mV，与中低温(20～25 ℃)阶段相比较，电压增加了近100 mV。35 ℃时，由图4 可见，最高电压已超过500 mV，且电压的稳定时间相比30 ℃时延长1倍，功率密度达到2 000 mW/m3。但当继续加温至40 ℃时，最高电压却不足150 mV(见图3)。实验结果充分表明：F026发生电子转移的最适温度在30～35 ℃之间。温度过低时菌株活性不强，不能达到最大的产电量；而温度过高将超过菌株的生物耐受限度，反而降低了菌株的活性，影响MFC的产电性能。

2.3 pH对MFC产电特性的影响

图5 pH值对微生物燃料电池产电性能的影响Fig.5 Effect of different pHs on the electricity generation characteristics of MFC

pH对微生物燃料电池产电性能的影响见图5。实验采用可溶性淀粉为底物，将温度设定为35 ℃。由图5可看出，不同pH下MFC电压的差异性：pH为6和9时，MFC电压值都相对较低，为250 mV左右；pH为7时，MFC电压能达到450 mV左右；而pH为8时，MFC电压最高达到500 mV。实验结果表明，在中性偏碱性的环境中，最适合产电菌F026的生存，且MFC的电压能达到500 mV以上。

Puig等[17]指出MFC中阳极碱性基质有利于电能的产生，这与Pseudomonas属的F026适合在碱性环境下生存相吻合。而当pH为9时，电压反而下降，说明过碱性的基质不利于F026产生电能。根据生态学中的Shelford 耐性定律，同温度因子一样，pH作为限制因子也存在生物耐受范围，该因子的量不足或过多都会对微生物的生存产生一定的影响，表现在MFC的产电性能上就是电压值的变化。

3 讨 论

以F026为阳极产电菌制作MFC，考察了底物种类、运行温度和pH值对MFC产电性能的影响规律，结果表明：乙酸钠、葡萄糖、庶糖、D-木糖和可溶性淀粉5种底物中，F026在可溶性淀粉为底物的MFC中产电功率密度最大为1 550 mW/m3。因此，依据碳源对MFC的产电性能的影响规律，生活污水和食品加工行业废水均可作为F026的底物利用MFC产生电能。MFC在15～45 ℃范围内运行时，F026最适生存温度在30～35 ℃之间，在35 ℃运行时，MFC的最高电压可达500 mV。阳极液的酸碱度对MFC产电性能有重要影响，F026最适合在中性偏碱性的环境下生存。以F026为阳极产电菌的MFC的最优运行条件：以可溶性淀粉作为底物，运行温度为35 ℃，pH为中性偏碱性。在此条件下MFC的电压可达到500 mV，功率密度可达到2 000 mW/m3。

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Electricity Generation Performances of Pseudomonas F026 in Microbial Fuel Cell

FEI Jiang-chi, TENG Yao, XIONG Li-zhi, WU Yu-xian, CHEN Yi-guang, HE Ze-qiang

(Coll.ofBiol.Res. &Environm'l.Sci.,JishouUni.,Jishou,Hunan416000)

An efficient electrogenic bacteriaPseudomonasF026 was domesticated by enriching and screening based on the reaction equipment of microbial fuel cell from the aeration tank of sewage treatment, and based on phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences and other means. The effects of substrate forms, temperature, pH, and other factors on electricity generation performances of the microbial fuel cell making F026 as an anode were investigated. The results showed that the optimal growing conditions for F026 were: soluble starch as substrate, under environment pH at neutral-meta-alkaline, and temperature range of 30～35 ℃. Under these conditions, the voltage of the microbial fuel cell could reach as high as 500 mV and the power density was as high as 2 W/m3.

microbial fuel cell; electrogenic bacterium; electrogenic performance;Pseudomonas

国家自然科学基金资助项目(5126200，51202087，51364009)；湖南省自然科学基金重点项目(12JJ2005)；湖南省教

费讲驰 男，硕士研究生。研究方向为污染生态学。E-mail：45356142@qq.com

2014-01-27；

2014-05-07

Q939.1

A

1005-7021(2015)01-0035-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.007

育厅项目(12A109，13K094)；湖南省科技计划重点项目(2012GK2017)；湖南省生态学重点学科建设项目(JSU0713)

滕瑶 女，硕士研究生。研究方向为环境生态学。

* 通讯作者。男，博士，教授，硕士生导师。研究方向为功能材料与废物资源化利用。E-mail：csuhzq@163.com