不同施用模式下高效氯氰菊酯对滑菇生长状态的影响

不同施用模式下高效氯氰菊酯对滑菇生长状态的影响

周小倩，李文莉，赵 珍，张菀苓，符婷婷，王继华*

(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨 150025)

摘要[目的]了解施用不同浓度的高效氯氰菊酯对滑菇生长状态的影响，以确定实际生产中该药剂施用的最佳稀释倍数。[方法]采用控制变量法，研究不同浓度的4.5%乳油状高效氯氰菊酯对滑菇C3-1和滑菇RH的菌丝体生物量、蛋白质含量和超氧阴离子自由基清除率等的影响。[结果]施用不同浓度的4.5%乳油状高效氯氰菊酯对滑菇的生长状态都有显著抑制作用，且抑制作用大小不同。当稀释倍数为4 000时，4.5%乳油状高效氯氰菊酯对滑菇C3-1和滑菇RH的生长都有相对较强的抑制作用；当稀释倍数为8 000时，滑菇RH的生长量、菌丝体的蛋白质含量和超氧阴离子自由基清除率均相对较高，均仅次于对照组；当稀释倍数为12 000时，滑菇C3-1的生长量、菌丝体的蛋白质含量和超氧阴离子自由基清除率均较高。[结论]综合分析，在保证高效氯氰菊酯除虫灭菌的药效情况下，4.5%乳油状高效氯氰菊酯稀释倍数以8 000～12 000倍为宜，此时药剂的使用对菌丝体生长的影响最小。

关键词施用模式；高效氯氰菊酯；滑菇；影响

中图分类号S436.46

基金项目大学生创新创业训练计划项目(201310231023)。

作者简介周小倩(1988- )，女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，研究方向：微生物遗传学与微生物生态学。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事微生物遗传学研究。

收稿日期2015-07-24

Effect of Different Concentrations of Beta-cypermethrin on Growth ofPholiotanameko

ZHOU Xiao-qian，LI Wen-li，ZHAO Zhen，WANG Ji-hua*et al(School of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin, Heilongjiang 150025)

Abstract[Objective] In order to make sure the optimal diluted multiples of beta-cypermethrin in production, effect of different concentrations of beta-cypermethrin on growth of Pholiota nameko was studied. [Method] Effects of different concentrations of 4.5% beta-cypermethrin EC on mycelium biomass, protein content and superoxide anion clearance of Pholiota nameko C3-1 and RH strains were studied by using the control variable method. [Result] The application of different concentrations of efficient 4.5% beta-cypermethrin EC had certain inhibitory effect on growth of Pholita nameko. When the diluted multiples were 4 000, 4.5% beta-cypermethrin EC had more strong inhibitory effect on growth of Pholita nameko C3-1 and RH strains. When the diluted multiples were 8 000, Pholita nameko RH had relatively high mycelium biomass, protein content and superoxide anion clearance, next to control. When the diluted multiples were 12 000, Pholita nameko C3-1 had relatively high mycelium biomass, protein content and superoxide anion clearance. [Conclusion] Under the conditions of ensuring control efficiency of 4.5% beta-cypermethrin EC, the suitable diluted multiples of 4.5% beta-cypermethrin EC were 8 000-12 000, and had the least effect on the growth of Pholiota nameko.

Key wordsConcentration; Beta-cypermethrin;Pholiotanameko; Effect

滑子菇(Pholiotanameko)别名珍珠菇、滑菇、光帽鳞伞，在日本地区被称为纳美菇，台湾地区叫“珍珠菇”，属无隔担子菌亚纲、伞菌目、丝膜菌科[1]。滑子菇原产于日本，后在我国黑龙江、辽宁等地进行人工大规模培养。其表面附着一层滑嫩可口、营养价值极高的黏多糖，蛋白质含量高于香菇和平菇，并且低热量、低脂肪，目前已成为世界上五大宗人工栽培的食用菌之一。但在人工栽培过程中，食用菌极易染菌，病虫害发生频繁，所以要使用农药[2-5]。高效氯氰菊酯是一种新型的拟除虫菊酯类杀虫剂，其组成成分主要为氯氰菊酯的高效体，在分子结构与生物活性方面类似于天然除虫菊酯的仿生农药，具有杀虫广谱、高效、低毒、低残留、对环境友好等优点，所以许多菇农选用高效氯氰菊酯作为滑菇栽培的杀虫剂。但如果药剂使用不当，就会引起杀虫效果较差或药害，造成损失。因此，找出有效的施用浓度是非常有必要的。为此，笔者测定了5种浓度梯度下高效氯氰菊酯对滑菇的影响，以期为滑菇生产过程中合理施用杀虫剂提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药剂。4.5%乳油状高效氯氰菊酯由江苏扬农化工集团有限公司生产。

1.1.2供试菌。菌株为筛选出的优势菌滑菇C3-1和滑菇RH，由哈尔滨师范大学微生物实验室提供。

1.1.3培养基。液体PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1 000 ml蒸馏水。

1.1.4试剂。BCA标准样品小牛血清蛋白、苯酚、浓硫酸、乙醇、NaCl、邻苯三酚、盐酸溶液和Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)均为分析纯。

1.2方法

1.2.1加药方式。为模拟菇房养殖的真实情况，首先活化接种滑菇优势菌滑菇C3-1和滑菇RH，接种于固体PDA斜面培养基上，菌丝体在20 ℃培养箱中遮光培养。12 d后取0.5 cm2菌丝体接种于液体PDA培养基上。根据滑菇C3-1和滑菇RH的实际生长情况，在其生长最快的时间点将不同浓度梯度的高效氯氰菊酯加入液体PDA培养基中。由预试验结果得知，滑菇C3-1在第12天生长速度最快，所以在相同培养条件下，在滑菇C3-1遮光培养第12天加入不同浓度的高效氯氰菊酯进行试验。滑菇RH则在第14天生长速度最快，所以将第14天作为后期加入药剂的时间点。

1.2.2加药培养基的配制。配制液体PDA培养基，将液体培养基定量100 ml分装于三角瓶中，121 ℃灭菌30 min，冷却后分别向其中接入0.5 cm2培养于固体PDA培养基中的菌丝体，继续培养。根据药剂的使用说明和前期的文献调查[6-8]，将滑菇C3-1在20 ℃下遮光培养至12 d、滑菇RH在20 ℃下遮光培养至14 d时，分别加入稀释倍数为4 000、8 000、12 000、16 000及20 000的高效氯氰菊酯，以培养基中加入等量无菌水作为空白对照组(CK)，每个浓度梯度重复3次。加药后继续培养至16 d。

1.2.3滑菇生长指标测定。反映滑菇生长情况指标有很多，通过对滑菇的生长量、营养成分中蛋白质的含量以及超氧阴离子自由基清除率的测定来评定不同浓度高效氯氰菊酯对其生长指标的影响，且用具体数据的变化直观反映出滑菇的生长情况。

1.2.3.1滑菇生长量。将20 ℃恒温遮光培养至18 d的菌丝体在烘箱中烘干至恒重后，测定菌丝体干重。

1.2.3.2菌丝体蛋白质含量。采用考马斯亮蓝法[9-11]。首先绘制标准蛋白曲线：称取0.1 g标准蛋白样品小牛血清蛋白(BSA)置于10 ml蒸馏水中，摇匀；按不同比例配制成不同浓度的蛋白溶液(表1)；取5.0 ml配制好的考马斯亮蓝G250溶液与配制好的不同浓度的蛋白质样液混匀，倒入比色杯中，用分光光度计测量其在595 nm波长下的OD值，绘制标准曲线。称取加入不同浓度高效氯氰菊酯的滑菇菌丝体各0.1 g，加入1.0 ml生理盐水，在组织研磨器中将菌丝体研磨至组织破碎成匀浆状后，4 ℃浸提3 h，12 000 r/min离心10 min，取其上清得到粗蛋白提取液。将蛋白粗提液进行适当稀释，当粗提液稀释30倍后适用考马斯亮蓝法，测定OD值，再与标准蛋白曲线作对照，计算每个样品中蛋白质的含量。

表1　标准蛋白曲线中不同浓度蛋白质配比　ml

1.2.2.3超氧阴离子自由基清除率。分别将5.0 ml提前研磨好的组织研磨液和1.4 ml Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.0)加入到大试管中，在25 ℃恒温水浴中预热20 min，向其中一支试管加入恒温水浴已预热的0.8 ml 30 mmol/L邻苯三酚溶液，另一支不加。分别用水稀释至25.0 ml，在室温下反应15 min，然后于25 ℃恒温水浴反应4 min，反应完全向其中滴入2滴10 mol/L盐酸终止反应。以水为参比，测定325 nm波长处体系的吸光度。设不加邻苯三酚时体系的吸光度为A1，加入邻苯三酚后体系的吸光度为A2，则超氧自由基产生量可用ΔA=A1-A2表示。计算超氧阴离子自由基清除率。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中，A0表示不含研磨液的吸光值；A1表示含有研磨液但不含邻苯三酚的吸光值；A2表示含研磨液又含邻苯三酚的吸光值[12-13]。

2结果与分析

2.1高效氯氰菊酯对滑菇生长量的影响由图1可知，低稀释倍数高效氯氰菊酯的使用下滑菇C3-1生长量较低，高浓度的高效氯氰菊酯对滑菇的生长有一定抑制作用，在稀释倍数为12 000和16 000时，滑菇C3-1的生长量有明显回升，几乎接近对照组(CK)，而稀释倍数为20 000时生长量又有所降低。

由图2可知，施用高效氯氰菊酯后对滑菇的生长有一定的抑制，当稀释倍数为4 000时，该药剂对滑菇RH生长状态的抑制作用最强;稀释倍数为8 000时，滑菇RH的生长量仅次于对照组；在稀释倍数为12 000、16 000、20 000时生长量均低于稀释倍数为8 000时，变化幅度很小，表明当该药剂稀释8 000倍时，滑菇RH的生物量最高。

图1　高效氯氰菊酯不同稀释倍数下滑菇C3-1菌丝体的生长量

图2　高效氯氰菊酯不同稀释倍数下滑菇RH菌丝体的生物量

2.2高效氯氰菊酯对滑菇蛋白质含量的影响标准蛋白曲线见图3。蛋白质线性回归方程为y=0.006 9x+0.124 9,R2=0.995,线性关系良好。

图3　蛋白质浓度标准曲线

由图4和图5可知，当稀释倍数为0时，滑菇C3-1和滑菇RH蛋白质含量都最高，分别为21.8%和22.3%。高效氯氰菊酯的使用对蛋白质有一定的抑制作用。其中，当高效氯氰菊酯稀释倍数为4 000时，滑菇C3-1蛋白质含量仅为10.3%。随着稀释倍数的增大，当高效氯氰菊酯的稀释倍数为12 000时蛋白质含量增长至19.5%，达到施用高效氯氰菊酯后的最高点，而在稀释倍数为16 000和20 000时，蛋白质含量降低，分别为16.7%和17.1%，说明当稀释倍数为12 000时，既能达到消除虫害又能最小地影响蛋白质的含量。对滑菇RH而言，在高效氯氰菊酯稀释倍数为4 000倍时，蛋白质含量较对照组明显下降，为17.8%；当稀释倍数为8 000时蛋白质含量达到施用药剂的最高含量，为18.9%，仅次于对照组；之后随着稀释倍数的增加滑菇蛋白质的含量反而下降，说明稀释倍数为8 000是最佳的施药倍数，能达到较好的效果。

图4　不同稀释倍数高效氯氰菊酯处理后滑菇C3-1蛋白质含量

图5　不同稀释倍数高效氯氰菊酯处理后滑菇RH蛋白质含量

2.3高效氯氰菊酯对滑菇超氧阴离子清除率的影响由图6可知，在空白对照组稀释倍数为0时，超氧阴离子自由基的清除率最高为52.4%；在加入稀释倍数为12 000的高效氯氰菊酯时，超氧阴离子自由基清除率较其他稀释倍数高；在稀释倍数为4 000时，超氧阴离子自由基的清除率最低，而在稀释倍数为16 000和20 000时，也有较高的超氧阴离子自由基清除率。

由图7可知，除对照组外，当高效氯氰菊酯稀释倍数为4 000时超氧阴离子自由基的清除率最低，为21.0%；当稀释倍数为8 000时超氧阴离子自由基的清除率达到了施用高效氯氰菊酯的最高值，为45.0%；之后随稀释倍数的增加超氧阴离子自由基清除率下降。

图6　不同稀释倍数高效氯氰菊酯处理后滑菇C3-1超氧阴离子自由基清除率

图7　不同稀释倍数高效氯氰菊酯处理后滑菇RH超氧阴离子自由基清除率

3讨论

研究农药的施用对食用菌生长情况的影响时，琼脂培养皿法是常用的方法。该研究改良了常规实验室采用的琼脂培养皿法来测定农药对食用菌菌丝体生长状况的影响，以菌丝体在液体PDA培养基中培养至生长最快点加药的方式作为研究点，既避免了由于高压灭菌而导致高效氯氰菊酯挥发失效的弊端，又减少了菌丝体培养初期对药物敏感的影响，使得研究结果更加准确、可靠。

该研究通过对不同稀释倍数的高效氯氰菊酯施用下的滑菇C3-1和滑菇RH的生长量、蛋白质含量和超氧阴离子自由基清除率的测定来衡量其生长状况。结果表明，在稀释倍数为4 000时，高效氯氰菊酯的浓度较高，对滑菇C3-1和滑菇RH菌丝体的生长量、蛋白质含量和超氧阴离子自由基清除率均为浓度梯度中的最低值，表明低浓度的高效氯氰菊酯对滑菇菌丝体的生长有一定的抑制作用，所以将农药稀释到4 000倍并非最佳选择。当高效氯氰菊酯的稀释倍数为12 000时，滑菇C3-1的生长量、菌丝体的蛋白质含量和超氧阴离子自由基的清除率均相对较高。对于滑菇RH来说，当高效氯氰菊酯的稀释倍数为8 000倍时，生长量、菌丝体的蛋白质含量和超氧阴离子自由基清除率均相对较高，综合3项试验结果分析，在保证高效氯氰菊酯除虫灭菌的药效情况下，将4.5%乳油状高效氯氰菊酯稀释8 000～12 000倍，药剂的使用对菌丝体的生长影响最小。因此，建议菇农在生产过程中将农药稀释成适当倍数再施用，既能达到除虫灭菌的目的，又能保证滑菇的生长质量。

由于是在实验室内测定的4.5%乳油状高效氯氰菊酯对滑菇菌丝体生长情况的影响，可能对试验有一定的限制，至于稀释的药剂浓度对滑菇子实体形成与生长的影响，有待实际生产中进一步验证。

参考文献

[1] 刘祖同，罗信昌.食用覃菌生物技术及应用[M].北京：清华大学出版社，2002.

[2] 何嘉，张陶，李正跃，等.我国食用菌害虫研究现状[J].中国食用菌，2004，12(1)：21-24.

[3] 罗孝坤，张陶，高观世，等.阿米西达对危害食用菌主要杂菌控制效果分析[J].中国食用菌，2005，24(2)：57-58.

[4] 宋金悌，华秀红.主要食用菌病虫表现与综合控制[J].中国食用菌，2005，24(5)：68-70.

[5] SODERLUND D M，CLARK J M，SHEETS L P，et al.Mechanisms of pyrethroid neuron toxicity：Implications for cumulative risk assessment[J].Toxicology，2002，171：3-59.

[6] 刘长令.国外农药品种手册[M].沈阳：全国农药工业信息站，2000：251-254.

[7] 周学政，赵振华.食用菌生产中农药使用的安全性原则[J].中国食用菌，2006，25(1)：19.

[8] 王升厚，马莲菊，杨东霞.平菇生产中高效安全杀虫剂的筛选[J].中国食用菌，2008，27(2)：48-49.

[9] 赵爽，刘宇，耿小丽，等.二十个平菇品种菌丝体蛋白质和多糖含量的研究[J].北方园艺，2011(8)：174-176.

[10] BRADFORD M M.A rapid and senstitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem，1976，72：248-254.

[11] 安志强，孙新顺，乔文庆.考马斯亮蓝法测定青霉素发酵液中可溶性蛋白质含量[J].河北化工，2010(9)：33.

[12] 刘建文.药理实验方法学[M].北京：化学工业出版社，2003：97-98.

[13] 林祥潮，黄晓东.中药对超氧阴离子自由基清除率的测定[J].广州化学，2012，37(1)：32-36.