海南中蜂微卫星DNA遗传多样性研究

高夫超 韩秀萍

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，牡丹江157041）

海南中蜂微卫星DNA遗传多样性研究

高夫超 韩秀萍

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，牡丹江157041）

本研究利用微卫星DNA方法对海南中蜂蜜蜂群体多态性进行研究，评估品种内的遗传变异。结果共检测到55个等位基因，平均每个位点的等位基因数为11，单个位点的等位基因数从8到13不等。所有位点的平均PIC值与平均期望杂合度分别为0.7569(0.0330)与0.8577(0.0267)。表明海南中蜂群体具有较高的多态性,显示出丰富的遗传多样性和较高的选择潜力，可为分析遗传多样性提供充分的信息。

海南中蜂；微卫星DNA；遗传多样性

海南中蜂(Apis cerana hainana)具有可利用零星蜜源植物，采蜜期长，适应性强，抗巢虫能力强，消耗饲料少及温驯性中等优点。它是海南独有的中华蜜蜂种质资源，是以热带雨林为主的森林群落及传统农业的主要传粉昆虫[1]。海南中蜂在其与生态环境长期对抗适应中获得了独特的遗传基因，这种独特遗传基因在新品种选育中是必不可少的。但随着广东和广西的大陆中蜂大量的人为迁入，海南中蜂种质资源因遗传结构的改变已难以存在，抢救海南中蜂刻不容缓。海南中蜂遗传资源的保护已成为当务之急，保护海南中蜂也就是保护蜜蜂遗传基因的多样性[2]。

微卫星DNA序列是一种简单串联重复DNA序列。其重复单位为1～6个核苷酸，由10～50个重复单位串联组成，在整个基因组中分布广且密度高，具有分布广、多态性丰富等特点[3]。微卫星标记在构建蜜蜂遗传连锁图谱、评价遗传多样性和群体进化、绘制系统发生树以及基因定位等研究显示出很强优越性和应用性[4]。利用13对微卫星引物从DNA水平上分析海南中华蜜蜂群体内的遗传变异，评估其群体遗传结构，为保护中华蜜蜂种质资源和遗传多样性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验采集了海南省海口市、琼中市等地区中华蜜蜂群体，采集群数为30群，每群采集成年工蜂数为10只，并用无水乙醇溶液浸泡保存。

13对微卫星引物信息列于表1，由上海生工生物公司合成，引物序列参考NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)等网站报道。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取：采用常规的苯酚/氯仿抽提法提取[5]，加TE溶解，－20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增条件及程序20μl反应体系：模板DNA（50ng/μl）1μl；10×buffer缓冲液为1.8μl；dNTP(10mmol/ L)1.5μl；Mg2+(25mmol/L)1.6～2.0μl；上游引物1.0μl；下游引物1.0μl；Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl；dd H2O11.5～11.9μl。

程序：95℃预变性5 min；95℃变性45s，54～59℃退火35s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸8min；4℃保存。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物多态性检测：1.5%琼脂糖凝胶电泳检测是否有扩增产物，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性，银染显色[6]。利用K成像系统计算分子量大小。

1.3 统计分析

1.3.1 等位基因频率等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式如下：

式中：P i为等位基因的频率；i为某一微卫星位点上的第i个等位基因；j1j2…jn为与i共显性的第1到第n个等位基因；n为该微卫星位点上等位基因数目。1.3.2杂合度(Heterozygosity,H)公式如下：

其中qi为第i个等位基因基因频率；n为等位基因数。

1.3.3 多态信息含量(Plolymorphic Informa

tion Content,PIC)Bostein等（1980）提出，最初用于连锁分析时对标记基因多态性的估计，现常用来表示微卫星多态性高低的程度。

其中qi、qj分别为第i和第j个等位基因基因频率；n为等位基因数。

图1 W4位点部分PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

图2 H4位点部分PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

表1 13个微卫星位点的引物序列

2 结果与分析

2.1 蜜蜂微卫星DNA检测结果

2.1.1 PCR电泳检测结果

试验用13对微卫星引物对样本进行PCR扩增，特异的扩增产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染法显影、定影。根据不同基于片段电泳迁移率的不同，利用凝胶成像系统计算其分子量。部分微卫星引物PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱分别见图1、2。

2.2 群体内的遗传变异

通过对海南中蜂群体的13个微卫星座位的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共发现了92个等位基因，平均每个位点7个等位基因，表明所选择微卫星标记的遗传信息比较丰富。其中W3座位有14个等位基因，H1座位有10个等位基因。在W6座位存在9个等位基因，在W5座位存在8个等位基因，在W4和H2座位存在7个等位基因。在W2，H3，H5座位存在6个等位基因。在W1，H4，W7座位存在5个等位基因。在H6座位仅存在4个等位基因。所有位点的平均期望杂合度为0.7431，平均观察杂合度为0.4077，平均多态信息含量为0.7085，显示较高的杂合度与丰富的多态信息含量。

表2 13个微卫星标记等位基因数、等位基因大小、平均期望杂合度、多态信息含量

3 讨论

3.1 样本量

微卫星位点多态性越高，等位基因数目就越多，其基因丰富度等多样性指标的值就越高，有研究结果表明，样本量越大，所能观测到的每个位点的基因数、平均等位基因数就会越高，基因丰富度也越大，与这些指标的正相关性很显著，而与期望杂合度没有显著地相关性。样本大小与所观测到的每个位点等位基因数、平均等位基因数及基因丰富度指数均呈显著正相关[7,8]，而与期望杂合度无显著相关；微卫星位点多态性的高低直接影响所观测到的种群基因丰富度及其检测所需的样本量，对大多数种群遗传和分子生态学研究而言，30～50个个体是微卫星DNA分析所需要的最小样本量。本研究中在海南中蜂所取的样本量达到30个，已基本能满足研究需要。

3.2 群体内的遗传变异

本研究中13个微卫星位点是从已公布的西方蜜蜂标记中筛选出来的，分布于多条染色体或连锁群中，所给的数据具有一定的代表性和可比性。多态信息含量（PIC）作为衡量基因片段多态性较好的指标，PIC＜0.25时,为低度多态性位点;0,25＜PIC＜0.5时,为中度多态性位点;当PIC＞0.5时,该位点为高度多态性位点。多态信息含量关系到该位点使用效率及可用性，PIC越大，在一个群体中，该位点的杂合子比例就越大，提供的遗传信息就越丰富。本研究中所有13个位点均处于高度多态性位点，即所有位点平均PIC＞0.5,说明所选的13个微卫星标记能为分析遗传多样性提供可信度较高的信息。

等位基因数是反映群体遗传变异的一个重要指标，受样本量影响。本研究的13个微卫星位点中，平均等位基因数为7，这一方面说明本研究的样本量比较充分，另一方面进一步说明这13个微卫星引物在海南中蜂群体中基因频率分布比较均匀且提供的多态信息含量比较丰富，用其分析遗传多样性具有较高的可靠性和有效性。

[1]高景林,赵冬香,等.海南中蜂资源保护与利用[J].中国蜂业, 2010(2):16-20

[2]韦庭秋,高景林.海南省中华蜜蜂现状及其发展对策[M].福州:蜂产品信息交流会论文集,2009:418-422.

[3]黄思思.皖南山区中华蜜蜂遗传多样性研究:[D].安徽:安徽农业大学,2011.

[4]Moxon ER,Wills C.DNAmicrosatellites:Agents ofevolution[J].Sci Am,280(1):94-100.

[5]张纪刚,朱文进,王曦,等.微卫星标记及其在遗传育种中的应用[J].养猪,2001(2):34-35.

[6]张欣.分子实验指南[M].北京:中国科技出版社,2000.

[7]Park S D E.Trypanotolerance in West African Cattle and the Population Genetic Effects of Selection:[D].University of Dublin,2001,45(8) 867～845.

[8]Goudet J.FSTAT version Switzerland:Department of Ecology& Evolution:[D].LAUSANNE:UniversityofLausanne,2002.

Study on Microsatellite DNA Genetic Diversity of Apis cerana hainana

Gao FuchaoHan Xiuping
(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang 157041)

The research was aiming at studying the populations of Apis cerana hainana by the methods of microsatellite DNA polymorphism.,The result showed that 55 alleles were found in 13 microstaellite loci.The mean number of effective alleles was 11 and the number of alleles per locus ranged from 8 to 13.The average PIC and expected heterozygosity(He)of all loci were 0.7569(0.0330)and 0.8577(0.0267),respectively.These results indicated high polymorphism in therpopulation of Apis cerana hainana,suggesting heterozygosity and high choice potential,thus provide sufficient imformation for analysis of genetic diversity.

Apis cerana hainana;microsatellite DNA;genetic diversity

国家现代蜂产业技术体系（CARS-45-SYZ5)。

高夫超，男，副研究员，主要从事蜜蜂学研究，E-mail:mdjgfc@126.com