核桃壳与棉籽壳对蜜环菌菌索生长的影响比较*

李正军，程显好，陈蒙蒙，孙 磊，李维焕

（鲁东大学菌物科学与技术研究院山东省食用菌技术重点实验室，山东 烟台 264025）

核桃壳与棉籽壳对蜜环菌菌索生长的影响比较*

李正军，程显好**，陈蒙蒙，孙 磊，李维焕

（鲁东大学菌物科学与技术研究院山东省食用菌技术重点实验室，山东 烟台 264025）

探究核桃壳与棉籽壳对蜜环菌菌索生长的影响。在瓶栽和袋栽栽培过程中，采用单因素试验结合统计分析方法比较不同栽培原料的栽培效果。实验表明，菌索平均生长速度在核桃壳与麦麸培养料处理中生长最快；核桃壳与棉籽壳组合次之；棉籽壳与麦麸组合最慢。在蜜环菌培养过程中，进一步采用核桃壳与麦麸为主要原料，且比例为4:6时，可以明显促进蜜环菌菌索生长，而且可以缩短生长周期，提高产量。新的培养方法可用于蜜环菌菌索生产，为天麻和猪苓提供优质伴栽材料。

蜜环菌；菌索；固体培养；棉籽壳；核桃壳

蜜环菌（Armillariella mellea），俗称榛蘑，为担子菌纲（Basidiomycetes）白蘑科（Tricholomataceae）真菌，是世界范围内广泛存在的森林病原菌[1]，同时蜜环菌是一种珍贵的大型药 (食)真菌，是中药天麻（Gastrodia elata） 和猪苓（Polyporus umbellatus） 生长发育的必需伴生菌，有与天麻相似的药用价值[2-3]。

蜜环菌野生资源日益减少，人工驯化有一定的困难，到目前为止还没有商业性栽培生产的先例。国内外研究多以阔叶原木培养为主，而此种培养方式存在浪费森林资源、成本高、生产周期长、收益少等诸多弊端，对生态环境影响较大。因此，原有的生产模式不仅限制了蜜环菌自身的利用，还阻碍其伴栽天麻等的生产效率及生产规模，导致天麻在生产中的品种退化、产量不稳、质量降低[4]。棉籽壳和核桃壳都是农产品加工的副产物，来源广泛，价格便宜，研究其作为蜜环菌菌索培养的材料，具有推广应用前景。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1供试菌种

蜜环菌菌种，由鲁东大学菌物科学与技术研究院菌种保藏中心提供。

1.1.2母种培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，水1 000 mL，pH自然。

1.1.3原种培养基

GPY培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨6 g、酵母浸粉10 g、琼脂15 g，水1 000 mL，pH自然。

1.1.4栽培培养基

核桃壳、棉籽壳、麦麸等为主要原料，调节组分含量，配置不同的比例。

1.2实验设计

1.2.1探究不同培养料对蜜环菌菌索生长的影响

在熟悉蜜环菌生长特性的基础上，本着来源广泛、价格低廉、营养丰富等原则，寻找适合蜜环菌生长的培养料。由于供试原料有多种，本文只列出几种较具代表性的培养料，设计不同的试验配方，各组处理配方如表1。每组处理3瓶。每瓶装干料0.5 kg，含水量60%。通过观察记录菌索生长速度、生长势，确定最佳培养料成分。

1.2.2探究核桃壳与麦麸不同比例对蜜环菌菌索生长的影响

表1 不同培养料配方Tab.1　Formulae of different culture medium in this study

在确定最佳培养料的基础上，设置不同的核桃壳与麦麸比例梯度。各组处理配方见表2。每组处理3瓶。每瓶装干料0.5 kg，含水量60%。通过观察记录菌索生长速度、生长势以确定最佳配方。

表2　核桃壳与麦麸不同比例培养料配方Tab.2　Culture medium of different proportion of walnut shell and wheat bran

1.3实验方法

1.3.1母种的制作

采用PDA培养基，将马铃薯洗净去皮，再称取200 g切成小块，加水煮烂（煮沸20 min～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，稍冷却后再补足水分至1 000 mL，加入20 g葡萄糖，15 g～20 g琼脂，充分溶解后，分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20 min左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存。常规接种，于25℃培养15 d备用。

1.3.2原种的制作

采用GPY培养基，先把蛋白胨、酵母浸粉、琼脂等按比例加水后，加热并不断搅拌，待琼脂溶解，加入葡萄糖，搅拌，使其溶解，培养基配置好后，分装三角瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20 min左右后取出摇匀，冷却后贮存。将低温保存的蜜环菌母种接种于锥形瓶中，于25℃培养15 d备用。

1.3.3不同培养料对蜜环菌菌索生长的影响

培养料配制按表1，将核桃壳粉碎（小米粒大小即可），与其它培养料按照比例混匀，加水，使培养料含水量达到60%，装瓶或装袋，121℃灭菌2 h，自然冷却后，接入蜜环菌原种，于25℃左右条件下暗培养。分别记录各处理菌索长至培养料底部的时间，并计算出每组处理菌索生长速度，将各处理瓶相互比较，观察菌索生长势。菌索生长速度（V，mm·d-1）公式为：

V=H/T

式中：H表示培养料的高度（mm）；T表示菌索长至培养料底部的时间（d）。

1.3.4不同麦麸与核桃壳比例梯度对蜜环菌菌索生长的影响

培养料配制按表2，将核桃壳粉碎（小米粒大小即可），与其他培养料按照比例混匀，加水，使培养料含水量达到60%，装瓶或装袋，121℃灭菌2 h，自然冷却后，接入蜜环菌原种，于25℃左右条件下暗培养。分别记录各处理菌索长至培养料底部的时间，并计算出每处理菌索生长速度，将各处理瓶相互比较，观察菌索生长势。

1.3.5数据处理

采用Excel软件完成数据整理和计算；SPSS进行单因素方差分析；t-检验检测相关系数的显著差异性。

2　结果与分析

2.1不同培养料对蜜环菌生长的影响

不同培养料中蜜环菌菌丝生长势、菌索生长速度等指标情况见表3。

2.1.1不同培养料处理间菌索生长势比较

从表3可以看出蜜环菌可在各个处理中生长，但在核桃壳培养料中菌索生长势最好，具体表现为菌索乳白色或褐色条状，浓密，粗壮；而其它处理中菌索生长相对差一些，表现为菌索稀疏，纤细，颜色有的为深褐色，可能是有些老化的缘故。这表明，核桃壳与麦麸组合较其它培养料更加适合蜜环菌菌索生长。

2.1.2不同培养料处理间菌索生长速度比较

从表3可以看出，菌索在核桃壳与麦麸培养料处理中平均生长速度最快；核桃壳与棉籽壳组合次之；棉籽壳与麦麸组合最慢。菌索生长速度的方差分析见表4。

表3　不同培养料中蜜环菌菌丝生长情况比较Tab.3　Comparision on A.mellea growth in different culture materials

表4　蜜环菌菌索生长速度的方差分析Tab.4　Analysis of variance on the growth rate of A.mellea rhizomorph

通过表3菌索生长速度差异显著性测验和表4的方差分析表明，不同培养料处理间蜜环菌生长情况存在显著差异。由表4可以看出，在培养料相同的情况下，不同梯度处理间差异不明显。由于梯度为人为设置且仅有3个梯度，具体影响将在下面的试验中分析讨论。

综上所述，蜜环菌在核桃壳与麦麸组合的固体培养基中，菌索生长势良好，与其它组合相比更适合蜜环菌菌索的生长。因此在进一步的实验过程中将着重探讨不同的麦麸与核桃壳比例对蜜环菌营养生长的影响。

2.2不同麦麸与核桃壳比例对蜜环菌生长的影响

不同麦麸与核桃壳比例配方，对蜜环菌菌丝生长势、菌索生长速度等指标影响见表5。

表5　不同麦麸与核桃壳比例配方中蜜环菌生长情况比较Tab.5　Comparison on growth of A.mellea in different ratio of wheat bran and walnut shell

2.2.1不同麦麸与核桃壳比例配方间蜜环菌菌索生长势比较

从表5可以看出，配方D4～D8中菌索生长总体良好，具体表现为菌索乳白色条状，浓密，粗壮；而其他处理的菌索生长情况相对差一些，菌索生长比较浓密，有些纤细，呈白色条状或细根状。

2.2.2不同麦麸与核桃壳比例配方间蜜环菌菌索平均生长速度比较

从表5可以看出，蜜环菌可在各个配方中生长，但菌索生长速度随着麦麸与核桃壳比例的增加，菌索生长速度逐渐加快，当比例达到6:4（配方D7）时菌索生长速度最快，此后，随比例的增加，菌索生长速度逐渐减慢。不同麦麸与核桃壳比例配方中蜜环菌菌索生长速度方差分析见表6。

通过表6分析表明，各处理间菌索生长速度存在差异，且根据试验数据统计分析得出，菌索平均生长速度与原料比例的相关系数为r＞0.754，相关达到显著水平。D6～D8处理组中蜜环菌菌索生长良好。

3　结论与讨论

本实验中，通过不同种类的C源影响蜜环菌菌索生长的结果可以看出，核桃壳与其他C源相比，能够促进蜜环菌菌索的生长。将核桃壳作为蜜环菌菌索生长的C源，能够促进菌索的萌发以及生长，为蜜环菌子实体的萌发及其伴栽菌 (如天麻等)的生长提供必要条件。

不同药（食）真菌的生长发育对营养物质有着大致相似的要求，营养物质包括C源、N源、无机盐和生长素类。有研究表明蜜环菌生长在对氮源的利用上，不管无机氮还是有机氮，蜜环菌生长速度差别小于不同C源之间的差别，蜜环菌对不同C源的利用能力有较大差别。蜜环菌对糖的利用明显优于相应的糖醇[5]。因此，选择合适的C源是促进蜜环菌菌索生长的前提。张海珠等[6]通过核桃壳处理发现，其壳多糖由D-甘露糖、鼠李糖、半乳糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-阿拉伯糖等11种单糖组成。正是由于核桃壳丰富的糖类为蜜环菌菌索的生长提供了生长所必需的C源，从而保证了蜜环菌菌索的生长。

另外，本实验中通过设计不同培养原料比例梯度发现不同的碳氮比对蜜环菌营养生长也有显著影响：配方D6～D8中，菌索生长状态较好，生长速度较快。由此可以看出不同的碳氮比对蜜环菌的营养生长，即菌索的生长具有较大的影响。

表6　不同麦麸与核桃壳比例配方中菌索生长速度方差分析Tab.6　Variance analysis on growth rate of A.mellea rhizomorph in different ratio of wheat bran and walnut shell

核桃壳的主要成分有木质素、纤维素和半纤维素等碳水化合物。谢夏阳[7]发现碳氮源对菌种产纤维素酶的能力有影响，不同菌种产纤维素酶对碳氮源的要求不同；另外，范寰等[8]发现真菌降解木质素能力源于其所产生的酶系统，而C源和N源以及其比例是其降解木质素和产酶的一个极为重要的影响因素，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶是分解木质素的主要酶系，不同碳氮源以及不同的比例对分解木质素酶的产生有很大影响，从而影响了真菌利用木质素的能力。通过以上研究，可以表明合适的C源、N源，以及适宜的碳氮比，可以保证真菌体内分解纤维素以及木质素等酶系的产生，从而更好地利用培养基中的营养成分，保证自身的生长。蜜环菌作为真菌的一种，在其生长的过程中，可以合成分解纤维素与木质素的酶系。通过选择合适的碳氮源以及最佳的比例，可以很好地促进酶系的产生，从而可以更好地利用培养基中的C源和N源，促进蜜环菌菌索的生长。

本实验中，在以核桃壳为C源的培养基中，蜜环菌菌索生长浓密，粗壮，呈现树根状乳白色或浅褐色，生长速度较快。除了上述分析的原因之外，还可能是由于核桃壳中某种特定的糖类含量比较高而促进了菌索的生长；或者是核桃壳中某种特殊的物质对蜜环菌菌索的生长具有刺激作用，比如核桃醌、氢化胡桃醌、β－葡萄糖甙、鞣质、没食子酸等，这些有机类物质是一般碳源所缺乏的；亦或是核桃壳中某种微量元素的含量比较高，从而大大促进了蜜环菌菌索的生长，使其呈现粗壮、浓密的生长势。具体原因还需要进一步的探讨和验证。

野生蜜环菌资源日益减少，阻碍了蜜环菌以及其伴栽猪苓和天麻的开发与利用。而由于蜜环菌生长需要菌材以及在人工合成培养基中不能很好地生长等原因导致蜜环菌人工驯化困难[9]。天麻和猪苓作为重要的中药材品种，其生长过程都离不开蜜环菌。蜜环菌为天麻或猪苓的生长提供的营养成分中，碳源成分应当是交换量最大的部分。蜜环菌固体培养特性表明，其极易利用甘露糖而不易利用甘露醇[5]，所以在菌体中积累了较多量的甘露醇。杨峻山等[10]从蜜环菌的菌丝中分离得到了甘露醇和赤藓醇等糖醇类成分，由此可以推测甘露醇有可能是蜜环菌为其伴栽猪苓或天麻提供的主要碳源营养。因此，实现蜜环菌的人工驯化和高产是开发蜜环菌及其伴栽资源的首要条件。

本研究将核桃壳用于蜜环菌的营养生长，为蜜环菌子实体的萌发以及其伴栽猪苓、天麻的生长提供了必要条件。由于核桃壳价格低廉，属于易获得的产品加工下脚料，从而克服了现有蜜环菌栽培技术的诸多弊端，打破了蜜环菌阔叶树木木段培养的传统观念，在低投入的基础上，实现高收益，而且具有菌胚全部综合利用、无废弃物等优点。以节约资源、绿色环保、变废为宝的理念为蜜环菌乃至天麻等伴生真菌的人工栽培开辟新道路、新思维。

[1]Kile GA,Mcdonald GI,Byler JW.Agriculture handbook No. 691[M].Washington:USDA Forest Service,1991:102-121.

[2]王秋颖，徐锦堂，郭顺星，等.猪苓与蜜环菌营养关系的初步探讨[J].中国中药杂志，2000，25（8）：472-473.

[3]徐锦堂，冉砚珠.中国天麻栽培学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：1-294.

[4]卢学琴.蜜环菌菌株对天麻素含量的影响[J].中药材，2007（10）：1210-1212.

[5]程显好，郭顺星.蜜环菌固体培养特性[J].中国医学科学院学报，2006（4）：553-557.

[6]张海珠，邓水来，张海，等.泡核桃壳多糖中单糖的组成及测定[J].中成药，2012（12）：2372-2376.

[7]谢夏阳.碳氮源对不同菌种产纤维素酶影响的研究[J].科技创新导报，2012（22）：4-5，8.

[8]范寰，梁军锋，赵润，等.碳氮源对复合木质素降解菌木质素降解能力及相关酶活的影响[J].农业环境科学学报，2010（7）：1394-1398.

[9]顾雅君，张明艳，唐宏亮，等.蜜环菌和天麻、猪苓的关系及尚未大量人工驯化原因[J].中国食用菌，2008（6）：20，28.

[10]杨峻山，苏亚伦，王玉兰，等.蜜环菌菌丝体化学成分的研究—Ⅶ.丙酮提取物中化学成分的分离与鉴定[J].药学学报，1991（2）：117-122.

Influence Comparison of Cotton Seed Shell and Walnut Shell on the Growth of Armillariella mellea Rhizomorph

LI Zheng-jun,CHENG Xian-hao,CHEN Meng-meng,SUN Lei,LI Wei-huan
(Ludong University Institute of Mycological Science and Technology,Shandong Province Fungal Product Development Lab, Yantai 264025,China)

The influence of cotton seed shell and walnut shell on the growth ofArmillariella mellearhizomorph was studied.In the cultivition process of bottle culture and bag culture,the single factor test was used to explore the influence of each parameter.Rhizomorph average growth rate was the fastest in the walnut shell with wheat compost,and rhizomorph average growth rate was the slowest in the cotton seed shell with wheat compost.When the ratio of walnut shell and wheat was 4∶6,it could promote the growth of rhizomorph and shorten the growth time of A.mellea rhizomorph.The new method could be used to A.mellearhizomorph cultivation.It was also used for the cultivition ofRhizoma gastrodiaeandPolyporus umbellatus.

Armillariella mellea;rhizomorph;solid cultivation;cotton seed shell;walnut shell

S646.9A1003-8310（2015）05-0029-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.008

山东省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队（SDAIT-11-011-11）。

李正军（1989-），男，在读硕士研究生，研究方向为蜜环菌的栽培研究。E-mail:lzj68687@126.com

**通信作者：程显好（1966-），男，博士，教授，主要从事菌物资源与开发等研究。E-mail:chengxianhao@sohu.com

2015-07-22