应用GC-O和GC-MS研究豉香型白酒挥发性香气成分*

范海燕，范文来，徐岩

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡，214122)

豉香型白酒是广东省有着悠久历史的地方性传统产品，具有“玉洁冰清、豉香独特、醇和甘滑、余味爽净”的特点［1］。豉香型白酒以大米为原料，蒸煮冷却后加入适量水及20%～22%的大酒饼，在28℃左右液态下发酵约20 d后，蒸馏得乙醇体积分数为31% ～32%的酒，俗称斋酒。斋酒转入多年浸泡酒肉的陈年肉缸，并加入经加工的一定量肥猪肉浸泡30 d，经过滤、勾兑后成为成品酒。其独特之处:一是在大酒饼的生产中加入20% ～22%的黄豆;二是斋酒经肥猪肉浸泡;三是液态发酵［1］。

1975年，广东石湾酒厂［2］对豉香型白酒酿造用水、酒曲制造、烧酒酿制以及企业标准进行了描述，由此拉开了研究豉香型白酒的序幕。1995年，研究人员［3］应用GC-MS技术检测了豉香型白酒中的挥发性成分，定量了66种挥发性物质，包括酯类25种、醇类21种、酸类8种、羰基化合物9种、缩醛类3种。作者认为2-苯乙醇、庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯和3-甲硫基-1-丙醇是豉香型白酒的特征成分。众所周知，2-苯乙醇呈玫瑰花或蜂蜜的气味，3-甲硫基-1-丙醇呈煮土豆气味［4］。庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯没有相关文献记载其有呈香特征，作者也没有对这些化合物进行感官闻香鉴定。2010年，研究人员［5］应用顶空固相微萃取(HSSPME)结合GC-MS技术定量了豉香型白酒中118种挥发性成分。到目前为止，大多数文章着重于豉香型白酒生产工艺的探讨［1-2，6］和挥发性成分的检测上［3，5］，而没有使用风味化学研究的方法如GC-O等研究其风味成分。

近年来，GC-O技术已广泛应用于我国饮料酒的香气成分分析中，如白酒［7-8］、黄酒［9-10］、苹果酒［11］和葡萄［12］等。本研究以豉香型白酒为研究对象，采用液液萃取法分离浓缩风味物质，并按照酸碱性分成中-碱性组分和酸性-水溶性组分，通过GC-O和GCMS分析，确定豉香型白酒中的重要香气化合物，为指导豉香型白酒的酿造、勾兑提供重要科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

豉香型白酒:由广东省九江酒厂有限责任公司提供;鉴定中标有 RI的化合物(表1):色谱纯，购于Sigma-Aldrich(上海)公司;无水乙醚、NaSO4、NaCl:分析纯，购于上海国药集团;戊烷:色谱纯，购于德国CNW公司。

Agilent GC 6890 N气相色谱和5975 MSD质谱仪，购于美国安捷伦公司;FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、DC-12氮气吹扫仪，购于上海安谱实验科技股份有限公司;ODP2闻香仪，购于德国Gerstel公司;超声波清洗仪，购于天津 Autosciennce公司;Milli-Q超纯水系统，购于美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液液萃取

根据Gao等人［7］的方法，取50 mL豉香型白酒酒样，用煮沸并冷却至室温的超纯水将酒样稀释至酒精度10%，加NaCl饱和。用20mL重蒸溶剂(乙醚∶戊烷=1∶1)在分液漏斗中重复萃取3次，然后合并有机相，再通过调节pH将萃出组分分成中-碱性组分和酸性-水溶性组分，加入适量Na2SO4于-20℃下干燥过夜，然后氮吹浓缩至200 μL，放置在-20℃下，待进行GC-MS和GC-O分析。

1.2.2 GC-O分析

参考Gao等人［7］的方法，挑选2名经过闻香训练的硕士研究生进行闻香分析。应用时间强度法，记录香气出现时间和香气特征，香气强度分为0～5六个等级。其中，“0”表示未闻到，“1”表示该化合物香气强度很微弱，“3”表示香气强度中等，“5”表示香气强度非常强。每人对每个组分闻香3次，每个化合物的香气强度为6次闻香结果的平均值。

1.2.3 GC-MS分析

色谱条件为:色谱柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm，J＆W Scientific)，进样口温度为 250 ℃，以氦气作为载气，流速为2 mL/min，进样量1 μL，不分流进样，样品随着载气一部分进入MSD检测器，另一部分进入ODP2闻香仪。色谱柱升温程序为:50℃保持2 min，然后以6℃/min的速率升至230℃，并保持10 min。闻香口的温度设定为280℃。

质谱条件:EI电离源;电子能量:70 eV;扫描范围:35～350 amu;离子源温度:230℃。

1.2.4 定性分析

根据改进的Kovats法计算化合物的保留指数(RI):在各组分中添加C5～C30烷烃的混合标样，进行GC-MS分析，根据烷烃的保留时间来计算化合物的RI［13］。通过质谱谱库检索与NIST 05 a.L库的标准质谱图比对定性。定性结果通过计算化合物的RI值、香气描述与标准品的RI值和香气描述比对确认。

2 结果与讨论

应用液液萃取法将豉香型白酒中的香气化合物进行分离浓缩，并根据酸碱性分为中-碱性组分和酸性-水溶性组分。通过GC-O闻香技术共检测到52种香气物质，包括羰基化合物13种、酯类10种、酸类9种、芳香族类8种、醇类7种、硫化物2种、内酯类2种和呋喃类1种。中-碱性组分和酸性-水溶性组分中分别检测出43种、17种香气物质。

2.1 中-碱性组分

由图1可以看出，中-碱性组分中检测到的香气化合物较多，主要包括羰基化合物、酯类、芳香族类和醇类化合物等。

图1 豉香型白酒中-碱性组分(NBF，左图)和酸性-水溶性组分(AF，右图)在GC-MS上的总离子流图及闻香强度图Fig.1 The total ionic chromatography and aroma intensity of the aroma-active compounds in neutral-basic fraction(NBF，right)and acidic-water soluble fraction(AF，left)of chixiang aroma type liquor

根据香气强度值，反-2-壬烯醛(香气强度 =3.7)、反-2-辛烯醛(香气强度=3.5)、辛醛(香气强度=3.2)、反-2-癸烯醛(香气强度=3.0)和壬醛(香气强度=3.0)是豉香型白酒中重要的羰基化合物，均呈脂肪气味。如表1所示，呈脂肪气味的反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛是在豉香型白酒中首次发现的化合物。不饱和醛类通常是啤酒的异嗅化合物［14-15］，也是烤猪肉的主要呈香化合物［16］。不饱和醛类由脂肪氧化而来［14，17］。猪肉中含有大量的脂肪［16］，可能会在豉香型白酒贮存的过程中氧化生成不饱和醛类。

表1 豉香型白酒中-碱性组分香气化合物的闻香结果Table 1 Aroma-active compounds of chixiang aroma type liquor in neutral-basic fraction detected by Osme

在中-碱性组分中检测到10种酯类化合物，主要呈水果香。己酸乙酯(香气强度=3.0)是豉香型白酒中重要的酯类化合物。丁二酸二乙酯是闻到的唯一的二元酸二乙酯，呈花香;前人认为的豉香型白酒的特征风味成分庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯和壬二酸二乙酯［3］，应用GC-O技术没有检测到。大多数酯类化合物由酸和醇在发酵和贮存过程中酯化而成［18］。

GC-O检测到8种芳香族类化合物，2-苯乙醇香气强度很高(香气强度=4.2)，呈强烈的玫瑰花香，是豉香型白酒中重要的香气物质。L-苯丙氨酸是生成2-苯乙醇的主要前体，它在酵母发酵的过程中通过 Ehrlich 路径生成 2-苯乙醇［19-20］。

在中-碱性组分中检测到7种醇类，主要呈现水果香和花香。其中，3-甲基-1-丁醇具有较高的香气强度(香气强度=3.0)，呈指甲油气味。醇类化合物主要来源于氨基酸和糖的降解［21］。

在豉香型白酒中检测到2种硫化物，3-甲硫基1-丙醇和3-甲硫基1-丙醛，均呈煮土豆气味。有研究认为3-甲硫基-1-丙醇是豉香型白酒的特征风味成分［3］，而在本研究中该化合物的香气强度仅为1.0。另外，3-甲硫基-1-丙醇在豉香型白酒中的含量在0.2～2.0 mg/L 之间，平均含量为 0.7 mg/L［22］，低于其阈值 2 110.41 μg/L［23］，可以推测对豉香型白酒的风味贡献很弱。根据香气强度值，在豉香型白酒中新发现的3-甲硫基-1-丙醛(香气强度=3.0)是其重要香气化合物。

本实验检测到2种内酯类化合物，γ-辛内酯和γ-壬内酯，呈现甜香。其中，γ-壬内酯香气强度较大(香气强度=3.3)，是豉香型白酒中重要的香气化合物。

注a:MS，化合物通过质谱检测;aroma，化合物通过闻香确认;RI，标准品的保留指数;RIFFAP，在FFAP极性柱上的保留指数;RIL，参考文献保留指数。

2.2 酸性-水溶性组分

由表2可知，豉香型白酒酸性-水溶性组分中的香气化合物种类较少，主要有脂肪酸、醇类，以及少量的芳香族类化合物。根据香气强度值(香气强度≥3.0)，乙酸和丁酸是豉香型白酒重要的脂肪酸，分别呈醋酸和奶酪气味。酸类化合物主要由发酵过程中的细菌产生［18］。

表2 豉香型白酒酸性-水溶性组分香气化合物的闻香结果Table 2 Aroma-active compounds of chixiang aroma type liquor in acidic-water soluble fraction detected by Osme

醇类化合物除了在中碱性组分中检测到外，在酸性-水溶性组分中也有检测到，主要贡献醇香和水果香。

在中-碱性组分和酸性-水溶性组分中均检测到了2-苯乙醇，且香气强度较大(≥3.0)，是豉香型白酒中重要的香气化合物。

3 结论

本研究采用GC-O闻香技术研究豉香型白酒的风味成分。应用液液萃取法分离浓缩酒样中的香气化合物，并将化合物按酸碱性分离，然后联用GC-O和GC-MS分析技术，更全面地诠释样品的信息。通过闻香分析检测到豉香型白酒中52种香气化合物。从化合物的种类和平均香气强度来看，羰基化合物是豉香型白酒的重要香气物质。其中，呈脂肪气味的反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛是在豉香型白酒中首次发现的香气化合物。研究发现豉香型白酒中香气强度较大(≥3.0)的化合物有:2-苯乙醇、反-2-壬烯醛、己酸乙酯、反-2-辛烯醛、γ-壬内酯、辛醛、3-甲基-1-丁醇、壬醛、3-甲硫基-1-丙醛、反-2-癸烯醛、乙酸和丁酸。接下来，笔者将对重要香气化合物进行定量分析，结合香气活力值(OAV)，以及香气物质的重组缺失实验深入研究豉香型白酒的关键香气。

［1］ 李大和.低度白酒生产技术［M］.北京:中国轻工业出版社，2010.

［2］ 广东石湾酒厂.豉味玉冰烧［J］.食品与发酵工业，1975(1):18-22.

［3］ 冯志强，邱晓红.豉香型白酒香型研究［J］.酿酒，1995(4):75-84.

［4］ Grosch W.Evaluation of the key odorants of foods by dilution experiments，aroma models and omission［J］.Chemical Senses，2001，26(5):533-545.

［5］ 张五九，何松贵，韩兴林，等.豉香型白酒风味成分分析研究［J］.酿酒科技，2010(12):58-64.

［6］ 沈怡方.白酒生产技术全书［M］.北京:中国轻工业出版社，1998.

［7］ GAO W，FAN W，XU Y.Characterization of the key odorants in light aroma type Chinese liquor by gas chromatography-olfactometry，quantitative measurements，aroma recombination，and omission studies［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62(25):5 796-5 804.

［8］ WANG X，FAN W，XU Y.Comparison on aroma compounds in Chinese soy sauce and strong aroma type liquors by gas chromatography-olfactometry，chemical quantitative and odor activity values analysis［J］.European Food Research and Technology，2014，239(5):1-13.

［9］ CHEN S，WANG D，XU Y.Characterization of odor-active compounds in sweet-type Chinese rice wine by aroma extract dilution analysis with special emphasis on sotolon［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61(40):9 712-9 718.

［10］ CHEN S，XU Y，QIAN M C.Aroma characterization of Chinese rice wine by gas chromatography-olfactometry，chemical quantitative analysis，and aroma reconstitution［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61(47):11 295-11 302.

［11］ XU Y，FAN W，QIAN M C.Characterization of aroma compounds in apple cider using solvent-assisted flavor evaporation and headspace solid-phase microextraction［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(8):3 051-3 057.

［12］ FAN W，XU Y，JIANG W，et al.Identification and quantification of impact aroma compounds in 4 nonfloral Vitis vinifera varieties grapes［J］.Journal of food science，2010，75(1):S81-S88.

［13］ 范文来，徐岩.酒类风味化学［M］.北京:中国轻工业出版社，2014.

［14］ Vanderhaegen B，Neven H，Verachtert H，et al.The chemistry of beer aging-a critical review［J］.Food Chemistry，2006，95(3):357-381.

［15］ Tan Y，Siebert K J.Quantitative structure-activity relationship modeling of alcohol，ester，aldehyde，and ketone flavor thresholds in beer from molecular features［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(10):3 057-3 064.

［16］ XIE J，SUN B，ZHENG F，et al.Volatile flavor constituents in roasted pork of mini-pig［J］.Food Chemistry，2008，109(3):506-514.

［17］ Belitz H D，Grosch W，Schieberle P.Food Chemistry［M］.New Delhi，India:Springer Berlin Heidelberg，2009.

［18］ FAN W，QIAN M C.Identification of aroma compounds in Chinese‘Yanghe Daqu’liquor by normal phase chromatography fractionation followed by gas chromatography/olfactometry［J］.Flavour and Fragrance Journal，2006，21(2):333-342.

［19］ Albertazzi E，Cardillo R，Servi S，et al.Biogeneration of 2-phenylethanol and 2-phenylethylacetate important aroma components［J］.Biotechnology Letters，1994，16(5):491-496.

［20］ Etschmann M，Bluemke W，Sell D，et al.Biotechnological production of 2-phenylethanol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59(1):1-8.

［21］ Reazin G，Scales H，Andreasen A.Mechanism of major congener formation in alcoholic grain fermentations［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1970，18(4):585-589.

［22］ 金佩璋.豉香型白酒中的3-甲硫基丙醇［J］.酿酒，2004，31(5):110-113.

［23］ 范文来，徐岩.白酒79个风味化合物嗅觉阈值测定［J］.酿酒，2011，38(4):80-84.

［24］ 范文来，徐岩.应用液液萃取结合正相色谱技术鉴定汾酒与郎酒挥发性成分 (下)［J］.酿酒科技，2013(2):17-26.

［25］ Michael C Qian，Thomas H Shellhammer.Flavor Chemistry of Wine and Other Alcoholic Beverages［M］.Oxford University Press，Inc，2012:303-338.