草鱼冷藏过程中肌肉蛋白质结构特征的变化*

王发祥，李强，俞健，李向红，王建辉，张付兰，刘永乐

(长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南长沙，410114)

蛋白质为草鱼肌肉组织的最重要组成部分，其冷藏过程中的降解和变性均会导致其功能丧失，从而直接决定了鱼肉的质量［5-6］。李晓波［7］认为，鲜肉发生腐败变质的过程，实际上是蛋白质的降解、脂肪的酸败和糖类的发酵作用的过程，其中蛋白质变性和降解是一个重要的腐败过程，其结果不仅导致鲜肉营养成分的破坏，而且还产生严重的臭味，有时还会分泌毒素等;而蛋白质变性或降解的实质是蛋白质分子中的次级键被破坏，从而引起其天然结构解体或二级结构变化。本文旨在通过扫描电镜和红外光谱分析等方法，研究了冷藏过程中草鱼肌肉蛋白质的微观和分子结构的变化，以明确其结构特征的变化规律。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要仪器

新鲜草鱼，购自当地农贸市场，每尾约1.5 kg。

TGL20M冷冻高速离心机，长沙易达仪器有限公司;JSM-6700F扫描电子显微镜，日本JEOL公司;Nicolet-6700傅立叶变换红外光谱仪，美国尼高力公司;LS-45型荧光分光光度计，厦门亿辰科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同冷藏时间点蛋白质样品制备

分别取4 ℃ 贮藏下 0、2、4、6、8、10 d 的草鱼肌肉，绞碎后，称取10 g左右的样品于100 mL的离心杯中，按文献［8］最优条件提取肌肉蛋白质，提取液在常温下透析24 h脱除SDS及盐，经真空冷冻干燥得到蛋白质粉末，即为不同冷藏时间点蛋白质样品，4℃冷藏备用。

1.2.2 扫描电镜分析

蛋白质是细胞的产物，同时也是细胞中各种生命活动必不可少的物质，蛋白质分布在细胞的各个部位中。在构建模型时，学生应尽可能标记出各种高中阶段所学蛋白质及相应的生命活动，将复杂知识可视化、系统化。联系细胞的各个部位所进行的生命活动，思考会有哪些蛋白质的参与。如，细胞中的滑面型内质网上是否分布与脂质、糖合成的有关的酶、而粗面型内质网上是否分布与蛋白质加工有关的酶？细胞质基质中与细胞呼吸有关的酶（有氧呼吸第一阶段、无氧呼吸）有哪些？

分别取少量冷冻干燥的不同冷藏时间点的草鱼肉蛋白质样品，镀金处理60 s。然后以扫描电子显微镜观察的其微观形态结构。

1.2.3 傅里叶变换红外光谱分析

采用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)检测方法分析草鱼肌肉蛋白二级结构的变化情况［9-10］。一定量蛋白质样品置于干燥器内充分干燥后，取1 mg与100 mg KBr混合研磨后压片，置于全反射晶体的反射面上进行全波段(4 000～600 cm-1)扫描，每次试验对信号进行64次扫描累加，分辨率为4 cm-1，扣除背景后得到红外光谱图。利用OMNIC数据处理软件校正，限制谱带范围为1 600～1 700 cm-1;用Origin7.5软件中的Peakfit功能，将谱图进行两点基线校正;再以Savitsk-Golay函数平滑，二阶导数拟合。根据各指认峰积分面积计算出各种二级结构的相对百分含量。

1.2.4 表面疏水性分析

［11］采用 ANS(8-anilino-1-naphthalenesulfonate，1-苯胺基萘-8-磺酸)荧光探针法测定:称取蛋白样品0.01 g溶于 PB缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.0)并定容至100 mL，再取一定量以该缓冲液依次稀释成原浓度的 0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 倍备用。取不同浓度的蛋白质样品4 mL，加入50 μL的8 mmol/L ANS，设置激发波长为365 nm，发射波长为480 nm，测定其荧光强度，以荧光强度对蛋白质浓度作曲线，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质样品的表面疏水性指数。

1.2.5 游离巯基含量变化分析

参考 Ellman’s试剂法［12］稍作修改:不同冷藏时间点的蛋白质样品以11 mg/mL的SDS溶液配制成0.4%的蛋白质溶液，取1 mL加入0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液(含8 mol/L尿素、2%SDS和10 mmol/L EDTA，pH 6.8)中，混匀后取4 mL加入0.5 mL 0.1%的 DTNB{5，5'-dithiobis(2-nitrobenzoicacid)，5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)}试剂，45℃水浴30 min，在412 nm处测吸光值。以1.1%SDS溶液取代样品作空白对照，根据结果计算游离巯基含量。

2 结果与分析

2.1 显微结构变化分析

以扫描电子显微镜观察不同冷藏时间草鱼肌肉蛋白的超显微结构，结果如图1所示。可见，第0天的蛋白质颗粒结构完整，表面平滑，说明新鲜草鱼肌肉蛋白质聚合紧密，形态规则;冷藏第2天，蛋白质结构明显扭曲，但表面仍比较光滑;第4天，蛋白质表面开始出现细沟壑和孔隙，可能是因为蛋白质分子在组织酶的作用下开始水解;冷藏第6天，蛋白质逐渐解体、断裂，并出现了较大孔穴;第8天开始，蛋白质明显裂解成小片段;第10天时破碎愈加明显，颗粒更细。这说明在冷藏过程中，草鱼肌肉蛋白质会不断变性、降解，并可能最终降解为小分子片段。

图1 不同冷藏时期草鱼肌肉蛋白质的扫描电镜观察结果Fig.1 SEM results of grass carp muscle proteins at different cold storage time

2.2 二级结构变化分析

傅里叶变换红外光谱法是近十几年发展起来的对蛋白质的二级结构进行定量研究的方法，最多用于二级结构分析的红外谱带为酰胺I带(1 700～1 600 cm-1)［9-10］。图2为不同冷藏时期草鱼肌肉蛋白质的FT-IR图谱，根据各组相关峰位的指认及面积与蛋白质二级结构成分的对应关系［10-13］将分析结果列于表1。

图2 不同冷藏时期草鱼肌肉蛋白质的FT-IR图谱Fig.2 FT-IR spectra of grass carp muscle proteins at different cold storage time

表1 冷藏过程中草鱼肌肉蛋白质二级结构含量变化Table 1 Change in content of secondary structure of proteins during grass carp cold storage

可见，随着冷藏时间的延长，草鱼肌肉蛋白质无规卷曲含量则逐渐上升，第10天升至19.71%，升高了20.33%，说明蛋白质变性导致其无序程度增加;而α-螺旋结构含量从第4天开始逐渐下降，第10 d降至35.65%，下降了12.77%，表明冷藏过程中肌肉蛋白质分子中α-螺旋结构会向无规则卷曲结构转变，这与朱孔辉［14］等研究鲢鱼肌肉蛋白质的结果非常相似。

2.3 表面疏水性变化分析

不同冷藏时间点草鱼肌肉蛋白质的表面疏水性指数如图3所示。可见冷藏前4 d表面疏水性指数一直增加，主要是因为其不断变性引起折叠打开、分子结构逐渐伸展，导致部分原先埋藏在分子内部的疏水性残基逐渐暴露至其分子表面所致，这与Benjakul等［11］研究发现太平洋鳕鱼冻藏2 d后肌球蛋白疏水性增加2倍多的结果吻合;随着冷藏时间延长，疏水性指数又逐渐下降，可能是因为变性展开加速了蛋白质分子被组织酶水解，而随后降解成的小分子蛋白质又发生了重新折叠或聚合。

图3 冷藏过程中草鱼肌肉蛋白表面疏水性的变化Fig.3 Change in surface hydrophobicity of proteins during grass carp cold storage

2.4 游离巯基含量变化分析

巯基是蛋白质中最具反应活性的功能性基团之一，其含量变化在一定程度上反映蛋白质的聚合和变性程度［14］。草鱼冷藏过程中肌肉蛋白质中游离巯基的含量变化如图4所示。

图4 冷藏过程中草鱼肌肉蛋白巯基含量变化Fig.4 Changes in content of free sulfhydryl of proteins during grass carp cold storage

可见游离巯基含量与表面疏水性的变化趋势基本相同，即前4 d含量逐渐上升，由0 d的40.11 mol/g上升至第4天的57.53 mol/g的最高值，继续冷藏含量又开始下降，至第10天降至43.68 mol/g。游离巯基先升后降的趋势在很大程度上反映了草鱼冷藏过程中肌肉蛋白质结构变化的过程，蛋白质先受冷变性导致聚合体解开和空间结构伸展，一些二硫键被还原或原包埋于内部的巯基不断暴露，进而有利于酶将蛋白质分子降解为小片段;着冷藏时间的延长，暴露的巯基又会被氧化成二硫键，蛋白质小片段重新聚合，从而导致蛋白质原有功能丧失，鱼肌肉质量下降。

3 结论

本研究分析了冷藏过程中草鱼肌肉蛋白质显微结构、二级结构、表面疏水性及游离巯基含量的变化，从结构特性变化角度探讨了其逐渐变性和降解的过程。扫描电镜观察发现，蛋白质颗粒逐渐由表面平滑开始扭曲、断裂和破碎，直观反映了其变性和降解过程;二级结构含量分析表明，冷藏过程中蛋白质变性逐渐严重，无序程度增加，冷藏第4天开始α-螺旋向无规则卷曲转变，说明出现了不可逆的结构破坏;表面疏水性及游离巯基含量的变化间接反映了蛋白质分子内部次级键的变化，均呈现先上升至第4天后开始下降的趋势，再次印证了4 d为腐败的关键时间点，冷藏4 d后肌肉蛋白质开始由变性转变为结构破坏并逐步被降解，从而导致肌肉质量持续下降。

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