溶磷真菌的分离鉴定及其对新疆加工番茄种子萌发的影响

张佳佳，冯琳，武正芳，孙燕飞，朱新霞

（石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，石河子 832003）

溶磷微生物（Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM）是广泛存在于土壤中，能够将植物难以吸收利用的磷素转化为植物可吸收利用磷素的一类微生物[1]。近年来，从植物根际土壤中筛选具有活化土壤难溶无机磷能力的高效溶磷菌，已成为提高土壤磷有效性的研究热点[2-4]。

研究发现，真菌的溶磷能力普遍比细菌要高[5]。已报道的部分溶磷微生物除了具有溶磷活性外，还具有可以分泌某些植物激素类物质刺激植物生长的功能。种子萌发是植物个体生长发育的主要阶段，直接影响植物后期的生长发育和产量[6]。为了提高种子活力、加快种子萌发、促进发根、培育壮苗等，生产上一般会对种子进行处理，种子的微生物处理就是方法之一。王明有等[7]研究发现在种植番茄的过程中使用液体微生物菌剂，可以提高番茄的产量、可溶性固形物、番茄红素和Vc含量，改善产品风味，提高农产品品质。

目前，有关溶磷微生物对新疆加工番茄种子萌发影响的研究较少，本研究通过从加工番茄根际土壤中分离筛选溶磷真菌，研究其对加工番茄种子萌发的影响，以期为获得有益于新疆加工番茄生产应用的溶磷菌株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土样

供试加工番茄根际土壤采集于石河子蔬菜研究所。

1.1.2 供试加工番茄品种：

里格尔（87-5）。

1.1.3 培养基

无机磷培养基（分离筛选培养基）：葡萄糖 10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，琼脂 18 g，定容至 1000 mL，pH 7.0-7.5。121℃高压蒸汽灭菌20 min。

真菌培养基（PDA培养基）：马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30 min，用纱布过滤，滤液加葡萄糖20 g，琼脂 18 g，补足水至 1000 mL，pH自然。121℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 土样的采集及理化测定

2014年7月20号，采用对角线法从石河子蔬菜研究所，采集加工番茄植株根部深度5-20 cm的土样，去除地面植被、落叶、石砾和残根等杂物，充分混合土样后，分成两份土样：一份装入无菌的牛皮纸袋中，封口后4℃保存，用于溶磷真菌的筛选；一份在自然条件下风干，用研钵研细过2 mm筛用于土壤理化测定。用重铬酸钾容量法测定土壤有机质；凯氏定氮法测定土壤全氮；氢氧化钠消煮-钼锑抗比色法测定土壤全磷；碳酸氢钠法测定土壤有效磷；氢氧化钠熔融-火焰光度计法测定土壤全钾[8]。

1.2.2 溶磷真菌的分离筛选及溶磷能力的测定

溶磷真菌的分离筛选：将4℃保存的土样稀释10-104倍制成土壤悬液，取每个浓度的稀释液100 μL均匀涂布于无机磷固体培养基平板上，每个稀释度做3次重复，28℃恒温倒置培养5 d，选取溶磷圈较大的真菌菌株转接于新鲜的PDA培养基上纯化后，接入PDA斜面保藏。

定性测定：将纯化的菌株接种于无机磷培养基平板上，每菌株重复3次，28℃恒温倒置培养7 d，测定菌落直径d和溶磷圈直径D，根据D/d值初步确定菌株溶磷能力的强弱，对照组接种实验室保留的无溶磷能力的青霉菌（Penicillium）。

定量测量：活化溶磷菌株使其大量产孢，用无菌水洗下制成108cfu/mL的孢子悬浮液，按1%的接种量接种于无机磷液体培养基中，不接种的液体培养基为对照，每处理重复3次，于28℃ 200 r/min振荡培养7 d后取培养液10000 r/min 4℃ 离心10 min，取上清，通过钼锑抗比色法在700 nm处测定光密度，根据绘制的磷标准曲线计算上清液中的有效磷含量。

1.2.3 溶磷菌的鉴定

1.2.3.1 菌落形态特征和培养特征观察

方法参照文献[9-10]。

1.2.3.2 ITS rDNA鉴定

将筛选菌株接种于马铃薯液体培养基，28℃200 r/min振荡培养24 h后过滤，将获得菌丝体用液氮研磨，采用改良的CTAB法[12]获得菌株DNA。用真核生物 ITS通用引物 ITS1-F:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和 ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’扩增菌株ITS区域。PCR扩增程序为：94℃5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 8 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，经纯化后送至上海生工生物技术有限公司测序，将获得的DNA序列输入GeneBank，用Blast程序与数据库中的序列进行比较分析。

1.2.4 溶磷真菌对番茄种子萌发的影响

将溶磷能力较高的菌株接种于马铃薯液体培养基中，28℃ 200 r/min振荡培养2 d，备用。种子在处理前先用2%的NaClO溶液浸泡10 min，再用75%的酒精灭菌30 s后清水冲洗5次。试验设单菌液处理和混菌菌液处理；菌液浓度设置3个梯度：菌液在600 nm（OD600）处的光密度值分别是0.1、0.5和1.0，以无菌去离子水为空白对照（CK）。每处理的液体刚好浸没加工番茄种子，处理4 h后倒掉处理液，阴干。将各处理的种子200粒（每皿50粒，4次重复）均匀放入铺有3层无菌湿润滤纸的培养皿（Ф=9 cm）中，于25℃暗培养6 d。发芽期间每天定时喷洒无菌水2次并检查种子发芽情况，以胚根伸出种壳达1/2种长为发芽标准，按下列公式计算萌发特性：发芽率Gr=6 d种子发芽数/供试种子数×100%；发芽势Gp=3 d种子发芽数/供试种子数×100%；发芽指数GI=∑（Gt/Dt），式中，Gt为t天时的发芽数，Dt为对应的种子发芽天数。

实验数据采用SPSS 17.0和Excel 2003软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 供试土样理化测定

通过对采集的土壤进行理化测定，土壤基础养分结果为：有机质 32.43 g/kg、全氮 4.09 g/kg、全磷0.59 g/kg、有效磷 44.48 mg/kg、全钾 5.48 g/kg、pH 7.75。供试土壤中有机质含量丰富，但是土壤中可供植物吸收的有效磷仅占全磷的7.5%，土壤磷素利用率低。

2.2 溶磷真菌的分离筛选和溶磷能力的测定

从供试土样中共分离28株溶磷真菌，其中菌株3-1和3-2在无机磷培养基上生长较好，均具有较好的溶磷能力，因此选择这2株菌株作为本实验的供试菌株。

溶磷菌株3-1和3-2第3-7天的D/d值见表1。由表1可知：菌株3-1的溶磷圈明显，在生长的第4 d时能够将培养皿（Ф=9 cm）内的无机磷Ca3（PO4）2全部转化为可溶性磷，此时的D/d值最大，为2.05；菌株3-2在生长的第7天时D/d值为1.16。在液体无机磷Ca3（PO4）2培养基摇瓶培养条件下，第7天时菌株3-1和3-2的溶磷量分别是368.7、142.2 mg/L。

表1 溶磷真菌的定性能力测定Tab.1 The ability of qualitative determination of phosphate-solubilizing fungi

2.3 溶磷真菌的鉴定

2.3.1 形态特征

菌株3-1和3-2在PDA固体培养基上培养7 d的生长情况如图1。菌株3-1在PDA培养基上28℃恒温培养1 d后肉眼可见清晰的菌丝体，生长迅速，7 d时菌落直径65 mm，平坦，有辐射状沟纹，质地稍成絮状，分生孢子结构大量，表面呈炭黑色，偶尔有无色渗出液；菌落反面呈不同程度的黄色。菌株3-2在PDA培养基上28℃恒温培养7 d时菌落直径61 mm，平坦，质地为致密丝绒状，较厚，分生孢子结构多，颜色为黄绿至草绿色，初期较淡现黄色，老后稍深近于草绿色，有菌核形成反面淡褐色，在形成菌核的反面显现黑褐色斑点。

图1 菌株3-1和3-2在PDA固体培养基上培养7 d的生长情况Fig.1 Growth of the strains on the PDA medium at 7 d

（2）王光华等[15]研究发现，黑土区高效溶磷真菌曲霉属P39和P37的 D/d值分别为1.06和1.10，液体溶磷量仅为47.89和46.56 mg/g；范丙全等[16]培养溶磷草酸青霉第7 d时的D/d值为1.07-1.26。本研究从加工番茄根际土壤中分离筛选的溶磷真菌黑曲霉（Aspergillus niger）和黄曲霉（Aspergillus flavus），它们的D/d值分别达到了2.05和1.16，液体溶磷量分别为368.7和142.2 mg/L，表明筛选的菌株均具有较强的溶磷能力。黄曲霉因产生具有毒性的次级代谢产物黄曲霉毒素，在有关粮食和食品安全中研究较多，而目前有关黄曲霉具有溶磷能力未见报道。由于黄曲霉对生长环境要求不高，本研究筛选出的具有较强溶磷能力的黄曲霉，有望成为开发微生物肥料的优质种质资源。

（3）植物种子的萌发受到许多外在和内在因素的影响。农作物种子的萌发状态影响着成苗率和幼苗质量，而成苗率和幼苗质量是播种质量的重要因素，也是提高田间植株质量的关键因素。本研究用溶磷真菌菌液处理新疆加工番茄种子，通过发芽率、发芽势和发芽指数来说明种子活力的高低。试验表明筛选的2株溶磷菌株对新疆加工番茄种子萌发有显著的影响。从发芽率、发芽势和发芽指数综合来看，较高浓度的菌液抑制了种子的萌发，而较低浓度的菌液有助于提高种子的发芽率和种子活力。黑曲霉的发酵液产物主要是有机酸类和酶类，而这些发酵液中的有机酸类和酶类物质可能是促进种子萌发的关键因素[17-19]。

本研究发现筛选的2株溶磷菌株对加工番茄种子发芽率影响不如对种子活力影响明显，菌株3-1促进种子活力的影响要大于菌株3-2。溶磷菌株具体对新疆加工番茄种子萌发影响的机制，以及在农业生产上的应用有待进一步研究。

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