离子色谱-质谱联用法测定4-甲基咪唑的含量*

于淑娟　刘定波　徐献兵　吴鑫兰

(华南理工大学 轻工与食品学院， 广东 广州 510640)

离子色谱-质谱联用法测定4-甲基咪唑的含量*

于淑娟刘定波徐献兵吴鑫兰

(华南理工大学 轻工与食品学院， 广东 广州 510640)

摘要：为了简单、方便地精确定量和定性样品中的4-甲基咪唑，建立了一种采用阳离子交换色谱-质谱联用(IC-MS)技术准确检测4-甲基咪唑含量的新方法，该方法的检出限为0.25μg/L，线性范围为2.5～200μg/L，线性相关系数为0.9997，相对标准偏差为2.32%～4.25%，加标回收率为92.7%～96.3%.使用该方法对焦糖色素、可乐等样品进行检测，结果表明，该方法具有分离度高、灵敏度高、定量准确、精密度高、检出限低的特点.

关键词：离子色谱-质谱联用法；4-甲基咪唑；焦糖色素；美拉德反应；灵敏度；检出限

4-甲基咪唑(4-MeI)是Ⅲ、Ⅳ类焦糖色素生产过程中产生的一种具有毒性的有害成分[1].动物毒理学实验证明，4-MeI对小鼠的LD50值为370mg/kg，可致惊厥甚至诱发癫痫症[2].国际癌症研究机构将4-MeI列为2B类化合物(可能对人类致癌)[3].因此，快速、精确地检测焦糖色素和食品中4-甲基咪唑的含量是食品安全领域广泛关注的议题.

目前对4-MeI的常见检测方法有分光光度法[4]、高效液相色谱法[5-7]、气相色谱法[8-9]、气质联用法[10-11]及液质联用法[12-14]等.阳离子交换色谱法由于分离度好、保留时间适中，能够较好地将4-MeI与2-甲基咪唑(2-MeI)以及各种杂质分离，实现样品中4-MeI的准确定量；4-MeI在C18柱上保留时间较短，容易受到2-MeI和其他杂质的干扰，虽然研究者可以在C18柱分离过程中加入离子对试剂改善4-MeI与2-甲基咪唑以及各种杂质的分离度，但离子对试剂的加入会对仪器造成潜在的伤害.采用阳离子交换树脂的分析柱无需加入改性剂就可以直接分离4-MeI与2-甲基咪唑以及各种杂质.因此，采用阳离子交换色谱仪与质谱联用(IC-MS)可以简单、方便地实现精确定量和定性样品中的4-MeI.本研究采用阳离子交换色谱-质谱联用法检测美拉德反应体系中4-MeI的含量.

1实验

1.1材料与设备

4-甲基咪唑、2-甲基咪唑、氢氧化钠溶液(质量分数50%)、甲基磺酸(质量分数99%)，美国Sigma-Aldrich Chemical公司产品；甲醇、氨水、盐酸(质量分数35%～37%)，分析纯，德国Merck公司产品；亚硫酸钠，分析纯，广州化学试剂有限公司产品；葡萄糖、麦芽糖，分析纯，上海伯奥生物科技有限公司产品；D-木糖，生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司产品；实验用水为去离子水；可乐购买于当地超市；焦糖色素购自相应供应商.

LCQ FLEET质谱仪，美国Thermo Scientific公司生产；ICS-5000型高效离子色谱仪，美国Dionex公司生产；Ansys SPEC SCX Disc 15mg/3mL型固相萃取柱，美国Varian公司生产;0.45μm微孔滤头，美国Millipore公司生产.

1.2样品制备

参考文献[15]中的焦糖色素模拟系统设计方法，准确称取一定量的木糖、葡萄糖和麦芽糖，分别配制浓度为80mmol/L 的糖与氨水的混合液(其中糖与氨水的摩尔比为1∶1)各250mL.选取其中一种糖-氨水混合液，移液枪分别移取4mL糖-氨水混合液于多个密封试管中，同时加入不同浓度的亚硫酸钠溶液，反应液中亚硫酸根最终浓度依次为0、4、8、20、40、80和160mmol/L，糖与氨水的最终浓度为40mmol/L.在120℃油浴条件下反应120min，待反应结束后立刻冷却至室温，量取2.5mL反应液稀释定容至50mL，备用.

将一定体积的可乐样品在室温下用电磁搅拌器搅拌脱气30min，取3mL样品备用.

称取5g焦糖色素，加水溶解定容至10mL；再量取0.06mL定容后的焦糖色素样品，加5.94mL去离子水稀释，备用.焦糖色素中4-MeI的含量按下式计算：

W4-MeI=ρ测×[(5.94+0.06)/0.06]×10mL/5g；

其中：W4-MeI代表焦糖色素中4-MeI的含量，μg/g ；ρ测代表4-MeI的测定质量浓度，μg/mL.

1.3使用固相萃取柱预处理样品

参考Klejdus等[12]的方法，稍加改动，利用Ansys SPEC SCX Disc 15mg/3mL型的固相萃取柱萃取样品.萃取柱先后用1mL甲醇和1mL水处理.用20μL盐酸(0.1mol/L)酸化3mL上述已制备好的各种备用样品，使其通过萃取柱.加入1mL甲醇洗出杂质.用6mL氨/甲醇混合液(其中氨水与甲醇的体积比为1:20)洗脱出萃取柱中保留的萃取物.将收集的萃取液在39℃条件下蒸发至干，然后用3mL去离子水溶解样品，通过0.45μm的微孔滤头过滤，待IC-MS分析用.

1.4离子色谱与质谱条件

色谱分析采用ICS-5000型高效离子色谱仪，分离柱采用高效阳离子交换分析柱CS12A(250mm×4mm，戴安公司)和CS12A保护柱(50mm×4mm，戴安公司)，同时采用CSRS300阳离子抑制器(4mm，戴安公司)对洗脱液进行在线脱盐，抑制电流为47mA.流动相为20mmol/L的甲基磺酸，等度洗脱20min，恒定流速0.8mL/min，进样量25μL.

质谱分析采用APCI离子源离子阱质谱，使用选择离子监控(SIM)模式(监测准分子离子m/z=83)检测4-甲基咪唑.APCI源条件如下：选用正离子模式，离子源温度350℃，扫描范围(m/z)82～84，鞘气流速35arb，辅助气流速10arb，放电电流3μA，毛细传输管温度350℃.

2结果与讨论

2.1色谱分离结果

阳离子交换色谱对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑具有较好的分离度，与其他方法相比，可以消除质谱检测时2-甲基咪唑对4-甲基咪唑的干扰；采用质谱定量和定性4-甲基咪唑，有利于提高精密度和准确度；离子色谱质谱联用对2-甲基咪唑与4-甲基咪唑标准样品进行检测，结果如图1所示.

由图1可见，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的保留时间分别为10.47和14.17min，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑完全分离，并且峰形对称.采用文中所建立的方法对不同样品中的4-甲基咪唑进行检测，谱图见图1中B和C.尽管在测量实际样品时谱图中有部分杂质峰出现，但这些杂质峰的保留时间都在10min以前.因此，样品基质对4-甲基咪唑的保留时间和峰形没有多大影响.

图1　标准样品及实际样品的色谱图Fig.1　Chromatograms of the standards and actual samples

2.2线性范围和检出限

分别配制质量浓度为2.5、5、10、25、50、100、200μg/L的4-甲基咪唑水溶液为标准溶液，进样进行测定.以4-甲基咪唑的峰面积对其质量浓度做标准曲线，如图2所示.由图2可见，4-甲基咪唑的质量浓度在2.5～200μg/L范围内时具有良好的线性关系.按信噪比为3计算分析物的最低检测质量浓度，得该方法对4-甲基咪唑的检出限为0.25μg/L.

图2　4-甲基咪唑的标准曲线Fig.2　Standard curve of 4-methylimidazole

2.3文中方法的回收率和精密度

采用标准加入法进行回收率实验，对方法的精密度进行考察；加标后的糖与氨水反应液也通过固相萃取柱进行处理，并采用上述色谱操作条件进行测定；平行测定3次，实验结果如表1所示.由表1可见，反应样品中4-甲基咪唑标准品的加入量(加入量以每1g反应样品中加入的4-甲基咪唑标准品质量计)在0.25～0.75μg范围内时，测得4-甲基咪唑回收率范围为92.7%～96.3%.

表1加入不同量4-甲基咪唑标准品时4-甲基咪唑的回收率

Table 1Recoveries of 4-methylimidazole with various amounts of 4-methylimidazole standard being added

加入量/μg测得量1)/μg回收率/%相对标准偏差(n=3)/%0.250.2392.74.250.500.4896.33.170.750.7194.62.32

1)测得量以每1g反应样品中测得的4-甲基咪唑质量计.

2.4实际样品的测定2.4.1食品样品中4-MeI的测定

将所建立的IC-MS方法应用于可乐和焦糖色素样品中4-甲基咪唑的检测，实验结果见表2.

文献中柱前衍生高效液相色谱法[7]测得可乐中4-MeI的含量为0.112～0.185mg/L，由表2所示结果可见，本实验的测定结果(0.11～0.28mg/L)与该方法的测定结果基本保持一致；气相色谱-质谱联用法[10]测得焦糖色素中4-MeI的含量为7.5~212.0μg/g，本实验测定结果(90.85～101.47μg/g)与气相色谱-质谱联用法测定结果是可比较的，本实验测定结果在该方法的测定结果范围内；说明本实验建立的IC-MS方法可用于实际样品中4-MeI含量的检测.

表2不同样品中4-甲基咪唑的测定结果

Table 2Measurement results of 4-methylimidazole in different samples

样品4-甲基咪唑的含量相对标准偏差(n=3)/%可乐a(含糖)(0.11±0.02)mg/L4.3可乐b(无糖)(0.17±0.03)mg/L4.6可乐c(含糖)(0.22±0.03)mg/L3.7可乐d(无糖)(0.28±0.04)mg/L2.4焦糖色素a(101.47±1.36)μg/g5.8焦糖色素b(90.85±1.75)μg/g4.9

2.4.2美拉德反应中4-MeI的测定

采用IC-MS方法监测了亚硫酸根对美拉德反应体系中4-甲基咪唑含量的影响，结果如图3所示.

图3　亚硫酸根对美拉德反应体系中4-甲基咪唑含量的影响Fig.3　Effects of sulfite on the content of 4-methylimidazole in the Maillard reaction system

当反应体系中亚硫酸根浓度为0mmol/L时，糖-氨水反应液中4-MeI的含量为0.17～1.98mg/L，其中木糖-氨水反应体系4-MeI含量最高，其次为葡萄糖-氨水反应体系，麦芽糖-氨水反应体系4-MeI含量最低.原因可能是木糖更容易降解而产生丙酮醛等4-甲基咪唑的前体物质，麦芽糖则较难降解而产生丙酮醛等前体物质[16].

当反应体系中加入亚硫酸根时，所有反应体系中的4-甲基咪唑含量随着亚硫酸根浓度增加先增加后降低.麦芽糖-氨水反应体系中，当亚硫酸根浓度低于40mmol/L时，随着亚硫酸根浓度增加，4-甲基咪唑的含量显著增加，亚硫酸根浓度为40mmol/L时，4-甲基咪唑含量达最大值3.27mg/L.与木糖-氨水、葡萄糖-氨水反应体系相比，麦芽糖-氨水反应体系中亚硫酸根对4-甲基咪唑生成的促进作用最明显.另外，在不同反应体系中，促进4-甲基咪唑生成的最高亚硫酸根浓度分别是：木糖-氨水体系为20mmol/L，葡萄糖-氨水体系为40mmol/L，麦芽糖-氨水体系为80mmol/L.这可能是因为：在一定反应时间内，亚硫酸根的加入会促进美拉德反应体系中丙酮醛的生成[17]，丙酮醛是4-甲基咪唑的重要前体物质[16]，所以在一定浓度范围内亚硫酸根的加入最终促进4-甲基咪唑的生成；之后随着亚硫酸根浓度的继续增大，虽然一方面亚硫酸根可以促进体系中丙酮醛的生成，但是另一方面又由于亚硫酸根离子的亲核反应性，多余的亚硫酸根可与丙酮醛的羰基发生亲核加成反应，过量的亚硫酸根导致体系中丙酮醛最终含量减少，结果导致体系中丙酮醛生成的4-甲基咪唑含量减少.因此，亚硫酸根对4-甲基咪唑的形成也有促进作用，在生产焦糖色素过程中可考虑控制体系中亚硫酸根的含量.

3结论

通过对文中建立的阳离子交换色谱-质谱联用(IC-MS)技术检测4-甲基咪唑含量的新方法的检出限、线性范围、回收率和精密度的考察，以及该方法在实际样品检测中的应用，得出以下主要结论：

(1)该方法的检出限为0.25μg/L，线性范围为2.5～200μg/L，线性相关系数为0.9997，相对标准偏差为2.32%～4.25%，加标回收率为92.7%～96.3%；

(2)该方法检测4-甲基咪唑具有分离度高、灵敏度高、定量准确、精密度高、检出限低的特点，检测结果与已有的柱前衍生高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法等方法的检测结果是可比较的，该方法可用于实际样品中4-甲基咪唑的检测；

(3)当反应体系中加入亚硫酸根时，所有反应体系中的4-甲基咪唑含量随着亚硫酸根浓度增加先增加后降低.

[1] Moretton C,Crétier G,Nigay H,et al.Quantification of 4-methylimidazole in class III and IV caramel colors:validation of a new method based on heart-cutting two-dimensional liquid chromatography (LC-LC) [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(8):3544-3550.

[2] 郭小莉,陈敏,张世湘,等.毛细管气相色谱法测定焦糖色素中的4-甲基咪唑 [J].食品科学,2005,26(2):169-171.

Guo Xiao-li,Chen Min,Zhang Shi-xiang,et al.Determination of 4-methylimidazole in caramel color by capillary gas chromatography [J].Food Science,2005,26(2):169-171.

[3] Yamaguchi H,Masuda T.Determination of 4(5)-methylimidazole in soy sauce and other foods by LC-MS/MS after solid-phase extraction [J].J Agric Food Chem,2011,59(18):9770-9775.

[4] 赵俊平,高丽华,金伟伟,等.酱油中4-甲基咪唑含量测定方法的研究 [J].中国酿造,2010(7):89-91.

Zhao Jun-ping,Gao Li-hua,Jin Wei-wei,et al.Determination of 4-methylimidazol in soy sauce [J].China Brewing,2010(7):89-91.

[5] 张晓燕,芦春梅,郭娜,等.高效液相色谱法测定饮料中的4-甲基咪唑 [J].中国酿造,2013,32(5):148-150.

Zhang Xiao-yan,Lu Chun-mei,Guo Na,et al.Determination of 4-methylimidazole in drink by high performance liquid chromatography [J].China Brewing,2013,32(5):148-150.

[6] 陈洪兴,戴军,陈尚卫,等.高效液相色谱法测定焦糖色素中的4-甲基咪唑 [J].中国调味品,2006(6):53-56.

Chen Hong-xing,Dai Jun,Chen Shang-wei,et al.Determination of 4-methylimdiazole in caramel pingments by high performance liquid chromatography [J].China Condiment,2006(6):53-56.

[7] 王妙飞,王永华,郭新东,等.柱前衍生高效液相色谱法测定饮料中4-甲基咪唑的含量 [J].食品与发酵工业,2007,33(12):130-132.

Wang Miao-fei,Wang Yong-hua,Guo Xin-dong,et al.Determination of pre column dansylation of 4-methylimidazole by HPLC [J].Food and Fermentation Industries,2007,33(12):130-132.

[8] 郭小莉,陈敏,胡锦荣,等.气相色谱法测定酱油中的4-甲基咪唑 [J].食品工业科技,2004,25(7):125-127.

Guo Xiao-li,Chen Min,Hu Jin-rong,et al.Determination of 4-methylimidazole in soy sauce by gas chromatography [J].Science and Technology of Food Industry,2004,25(7):125-127.

[9] Wilks R A,Johnson M W,Shingler A J.An improved method for the determination of 4-methylimidazole in caramel color [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1977,25(3):605-608.

[10] Fernandes J O,Ferreira M A.Gas chromatographic-mass spectrometric determination of 4-(5)methylimidazole in ammonia caramel colour using ion-pair extraction and derivatization with isobutylchloroformate [J].Journal of Chromatography A,1997,786(2):299-308.

[11] 熊珺,陈美玲,赖毅东.固相萃取-选择离子气质联用法测定液态调味料中的4-甲基咪唑 [J].现代食品科技,2012,28(5):567-569.

Xiong Jun,Chen Mei-ling,Lai Yi-dong.Determination of 4-methylimidazole in liquid seasoning by solid phase extraction combined with gas chromatography/selected lon mass spectrometry [J].Modern Food Science and Technology,2012,28(5):567-569.

[12] Klejdus B,Moravcová J,Lojková L,et al.Solid-phase extraction of 4 (5)-methylimidazole (4MeI)and 2-acetyl-4 (5)-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-imidazole (THI)from foods and beverages with subsequent liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric quantification [J].Journal of Separation Science,2006,29(3):378-384.

[13] Wang J,Schnute W C.Simultaneous quantitation of 2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole,2-and 4-methylimidazoles,and 5-hydroxymethylfurfural in beverages by ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(4):917-921.

[14] Klejdus B,Moravcová J,Kubáň V.Reversed-phase high-performance liquid chromatographic/mass spectrometric method for separation of 4-methylimidazole and 2-acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)imidazole at pg levels [J].Analytica Chimica Acta,2003,477(1):49-58.

[15] Lee K G,Jang H,et al.Formation of carcinogenic 4(5)-methylimidazole in caramel model systems:a role of sulphite [J].Food Chemistry,2013,136(3/4):1165-1168.

[16] Moon J K,Shibamoto T.Formation of carcinogenic 4(5)-methylimidazole in Maillard reaction systems [J].J Agric Food Chem,2011,59(2):615-618.

[17] 于淑娟,马菲,徐献兵.Maillard反应体系中亚硫酸根对2-氨基-2-脱氧葡萄糖降解的影响 [J].华南理工大学学报:自然科学版,2013,41(10):34-39.

Yu Shu-Juan,Ma Fei,Xu Xian-bing.Effects of sulfite on degradation of 2-amino-2-deoxyglucose in Maillard reaction [J].Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition,2013,41(10):34-39.

文章编号：1000-565X(2015)02-0008-05

收稿日期：2014-05-21

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(31271889)； 广东省科技计划项目(2014B020205001)； 广州市科技计划项目(2013J4500036)

Foundation items： Supported by the National Natural Science Foundation of China(31271889)and the Science and Technology Project Item of Guangdong Province(2014B020205001)

作者简介：于淑娟(1955-)，女，教授，博士生导师，主要从事制糖工程、碳水化合物分子修饰的研究.E-mail: lfshjyu@scut.edu.cn

中图分类号：O658

doi：10.3969/j.issn.1000-565X.2015.02.002

Determination of 4-Methylimidazole Content via Ion
Chromatography-Mass Spectrometry

YuShu-juanLiuDing-boXuXian-bingWuXin-lan

(School of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong, China)

Abstract:In order to quantitatively and qualitatively determine the content of 4-methylimidazole in samples with simplicity, convenience and accuracy, a new method using cation exchange chromatography-mass spectrometry was developed. This method, with a detection limit of 0.25μg/L, a linear range varying from 2.5 to 200μg/L, a linear correlation coefficient of 0.9997, a relative standard deviation of 2.32%～4.25% and a recovery varying from 92.7% to 96.3%, was then used to test the 4-methylimidazole in caramel pigment, cola and some other samples. The results show that the proposed method is of high separation degree, good sensitivity, accurate quantification, high precision and low detection limit.

Key words:ion chromatography-mass spectrometry; 4-methylimidazole; caramel pigment; Maillard reaction; sensitivity; detection limit