等温扩增技术在检测食品中金黄色葡萄球菌的应用

◎兰 莹

（四川省疾病预防控制中心，四川 成都 610021）

金黄色葡萄球菌简称金葡菌，是微球菌科葡萄球菌属，分布广泛。金葡菌能够在人体的黏膜、鼻咽等处寄殖，因此在食品加工生产过程中，极易通过加工、销售等人员带菌导致污染，最终造成食物中毒事件的出现。通常情况下，容易遭受金葡菌污染度的食品包括：生/熟肉、乳和乳制品、蛋和蛋制品等等。当前，金葡菌已经成被列入我国食品卫生微生物检验的常规检测项目。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验设备

PCR 扩增仪；5417R离心机；SPX-150B-Z 生化培养箱；DNA/RNA/蛋白分析仪；UVIpro 凝胶成像系统[1]。

1.1.2 主要培养基

营养琼脂、营养肉汤、Baird-Parker 氏培养基、增菌剂、7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Petrifilm RSA.Count Plate、Baird-parker+RPFAgar。

1.1.3 生化试剂

LAMP反应试剂、PCR 反应试剂、引物、TE 缓冲液、TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、配制琼脂糖凝胶、500 mmol/LEDTA溶液、1 mol/LTris-HCl、10%SDS等等。

1.1.4 试验样品

通过无菌操作的方式在当地主要市场购买200份的试验样品，其分别为鲜牛乳、牛肉、鸡肉、猪肉以及其余肉制品，其中牛乳和肉制品分别准备60份和50份，其余均为30份。

1.2 试验方法

为了实现对等温扩增检测金葡菌的灵敏度以及人工污染检出限的有效对比，本试验分别采取了等温扩增检测技术（LAMP）和聚合酶链式反应技术（PCR）。

1.2.1 LAMP 试验方法

LAMP反应是在水浴锅内开展的，先令其在64℃水浴锅内进行反应，反应时间控制在20分钟，再令其在80℃水浴锅内继续反应，10分钟后反应结束。

反应完成后，用肉眼对反应体系浊度的变化情况进行观测，并通过高速离心的方式，验证管底是否存在白色的焦磷酸镁沉淀。此外，还需使用5μL的扩增产物和1μL6×lodding buffer进行混合，通过凝胶成像系统对1.5%琼脂糖凝胶电泳的结果进行观察和成像，看是否存在梯形条带，LAMP 反应是否已经发生[2]。

1.3 PCR试验方法

PCR的整个反应过程主要是在PCR 仪内开展的，第一步预变性94℃，保持4分钟；第二步是变性94℃，保持1分钟；第三步是退火58℃，保持0.5分钟；第四步延伸72℃，保持1.5分钟，循环35；第五步延伸72℃，保持3.5分钟。

使用5μL的PCR 产物和1μL6×lodding buffer进行混合，过凝胶成像系统对1.5%琼脂糖凝胶电泳的结果进行观察和成像，

2 结果与分析

2.1 检测金葡菌灵敏度分析

在本试验中，原始菌液的浓度是2.5×109CFU/mL，将其稀释了108倍后，通过LAMP进行反应，依旧发现存在白色的焦磷酸镁沉淀，能够看到梯形条带；当菌液的浓度稀释到了109倍时，则没有任何沉淀和梯形条带。对于PCR反应而言，当菌液的浓度稀释到106倍时，还存在特异性条带，继续进行稀释，则没有任何反应。如下图1所示即为LAMP和PCR检测金葡菌敏感性比较示意图。

图1 LAMP和PCR检测金葡菌敏感性比较示意图

根据上述结果，可以得出LAMP反应检测金葡菌灵敏度更高。

2.2 食品中金葡菌检出限分析

在试验中，使用浓度2.06×109CFU/mL的菌液对食品进行人工污染，然后再将金葡菌的 DNA提取出来，使用LAMP与PCR方法对进行试验。

当菌液浓度稀释到了107倍时，通过LAMP进行反应，依旧发现存在白色的焦磷酸镁沉淀，能够看到梯形条带；当菌液的浓度稀释到了108倍时，则没有任何沉淀和梯形条带，因此LAMP法对人工食品中金葡菌检出限是2.06×102CFU/mL。对于PCR反应而言，当菌液的浓度稀释到106倍时，就无法检测到金葡菌。如图2所示即为LAMP和PCR检测食品中金葡菌检出限比较示意图。

图2 LAMP和PCR检测食品中金葡菌检出限比较示意图

根据上述结果，可以得出LAMP反应检出限是PCR反应的100倍。

3 讨论

为了进一步验证等温扩增技术在检测食品中金黄色葡萄球菌的应用效果，本试验分别采用LAMP方法和PCR方法检测了200份的食品样品。通过试验发现，使用LAMP方法检测食品中金黄色葡萄球菌，仅仅需要60分钟即可，其中30分钟用于提取金葡菌 DNA，20分钟用于扩增，因此检测速度十分迅速，在食品安全监督管理中的可行性更高[3]。

将LAMP方法和PCR方法进行比较可以发现，LAMP 方法在对金葡菌 DNA进行提取时，没有十分严格的要求，相关的抑制因素也较少，尤其是对于扩增产物的检测更为容易，可以用肉眼直接观察是否生成沉淀，从而把握靶序列扩增与否。使用LAMP方法检测金黄色葡萄球菌不需要使用电泳与紫外进行观察，检测步骤方便简洁、检测精度更高，因此十分适用于技术、资金较为薄弱的基层检测机构，同时LAMP方法在现场快速检测中也具有较高的优势，值得推广应用。

[1]徐义刚,李苏龙,李丹丹,等.食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用[J].中国农业科学,2010,(8).

[2]朱水荣,丁水军.环介导等温扩增PCR技术检测金黄色葡萄球菌毒素基因的研究[J]. 中國衛生檢驗雜誌,2010(20).

[3]唐梦君,周生,葛庆联,等.应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J].现代食品科技,2011(27).