抗稻瘟病基因定位与克隆及其在分子育种上的应用

◎王 丹，肖应辉

（湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128）

水稻（Oryza sativa）作为世界上主要的粮食作物之一，它的生产关系粮食安全。稻瘟病是由真菌病原物Magnaporthe oryzae引起的，是水稻最严重的病害之一，严重威胁着世界的粮食生产[1]。据统计，从1975～1990年间，全世界由稻瘟病导致的水稻产量损失高达1.57 亿吨[2]。自20世纪末以来，我国稻瘟病每年发生面积均超过380 万hm2，所造成的产量损失达数亿公斤每年[3]。实践证明，控制此病害最经济、有效和环保的方法是利用寄主的抗性培育和种植抗病品种[1,4]，而应用分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）技术将多个具有不同抗谱的稻瘟病抗性基因聚合到同一个品种中，是培育具有持久抗瘟性品种的有效措施之一[5]。本文概述了迄今已定位及克隆的稻瘟病抗性基因，以及最近利用DNA分子标记加速抗瘟水稻品种选育的进展，并对当前抗性基因定位与克隆和它们在分子育种上应用所面临的问题进行探讨。

1 稻瘟病抗性基因定位与克隆

水稻中很多抗稻瘟病基因已经被定位和深入研究，目前，已经定位了86了抗稻瘟病基因，其中有25个基因被成功克隆。见表1。

表1 水稻中已克隆的抗稻瘟病基因以及与它们紧密连锁的标记

2 利用抗稻瘟病基因育种

过去30年，国际水稻研究所利用传统育种方法给优良品种导入了大量的抗病基因[6]。但是，传统育种方法有以下不足：育种周期长，导入的抗性基因少，育成的品种容易丧失抗性。加之抗稻瘟病育种还面临的两个常见问题是：第一，我们目前还不完全清楚持久抗性的遗传机理；第二，选择具有多个抗性基因的个体可能干扰育种进程，原因是，基因之间具有上位性。分子标记技术为解决这两个问题提供了可能，分子标记可以提高遗传分析的效率和加速得出结论，特别适用于多个抗病基因存在于一个品种中时[7]；与抗病基因连锁的分子标记作为选择工具加速选择抗病基因组合符合要求的品系[8]，利用这个工具我们可以利用用传统的方法培育持久抗病的品种。水稻分子遗传图谱问世加速了分子标记辅助选择技术（MAS）在育种上的应用[9,10]。

由主效抗病基因控制完全抗性基因已在育种中广泛应用，已有pi5、Pita、Piz和Pi2等通过MAS方法导入新的水稻品种[11-14]。但是，由于稻瘟病菌具有高度变异性和不稳定性，使得具有单一抗病基因的抗性品种经过2-3年推广种植后就成为感病品种[15]。对于此可应用聚合育种解决，如Hittamani等将稻瘟病抗性基因Pi5、Pi1和Pi1聚合到同一品系BLl24中[5]；陈红旗等利用分子标记技术聚合Pi1、Pi2和Pi1基因改良金23B的稻瘟病抗性[16]，以上的研究表明.分子标记辅助育种技术已成为多基因聚合的有效手段。

3 问题与展望

对于稻瘟病的研究，此前，抗性基因的定位和克隆是利用正向遗传学经典方法—QTL定位和图位克隆方法，但由于受研究材料遗传背景和分子标记密度制约，近年来定位新抗性基因和克隆已定位抗性基因越来越难，水稻基因组测序的完成，使得利用反向遗传学方法定位和克隆更多抗性基因成为可能，魏兴华等通过全基因组关联分析技术（Genome-wide Association Study, GWAS）分析了一个籼稻群体的稻瘟病抗性，检测到已克隆抗稻瘟病基因Pia，定位到Pif位点的候选基因，幷在第3染色体定位了新抗性基因[17]，一些研究人员提出GWAS定位方法存在假阳性，但通过参数优化和重复实验可以降低假阳性率[18]，因此，对于GWAS定位和克隆抗稻瘟病基因还需进一步研究。

抗性基因生产应用方面，广谱抗性基因往往比单一抗性的基因更具优势，由QTLs控制的部分抗性不具有小种专化性，抗性更持久[19]。隐性基因Pi21和抗穗瘟显性基因Pbl均为高水平的部分抗性基因，携带Pi21的抗源品种Owarihatamochi在日本应用80多年来一直保持高水平的部分抗性，携带Pbl的部分抗性品种也已在日本连续推广应用15年以上仍未丧失抗性。在育种上，Pi21可通过RNAi抑制显性基因的表达加以利用，Pbl基因则可通过分子标记辅助选择（MAS）或转基因手段直接利用。对于稻瘟病抗病育种，利用分子标记辅助选择育种已成为趋势，但面临如下问题：第一，技术成本高；第二，用于选择的分子标记决定表型的可靠性低。对于第一个问题，我们既要考虑成本，又要考虑产出，也就是加速育成品种，给育种带来了更高的收益。

[1]Ou SH. Rice diseases, 2nd edn. Commonwealth Mycological Institute, Kew,1985.

[2]Baker B, Zambryski P, Staskawicz B, Dinesh-Kumar S P. Signaling in plant-microbe interactions.Science,1997(276).

[3]Shen M G, Lin J Y. The economic impact of rice blast disease in China. In: Zeigler R S, Leong S A,Teng P S. Rice Blast Disease. England, UK, CAB international,1994.

[4]Zeigler R S, Tohme J, Nelson J, Levy M, Correa F.Linking blast population analysis to resistance breeding:A proposed strategy for durable resistance. In Zeigler RS, Leong SA, Teng PS (eds) Rice Blast Disease.CAB International and IRRI, Wallingford, United Kindom,1994.

[5]Hittalmani S, Parco A, Mew T V, Zeigler R S, Huang N. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice.Theoretical and Applied Genetics,2000(100).

[6]Mackill DJ, Salam MA, Wang ZY, Tanksley SD A major photoperiod sensitivity gene tagged with RFLP and isozyme markers in rice. Theor Appl Genet,1993(5).

[7]Paterson AH, Damon S, Hewitt JD, Zamir D,Rabmowitch HD, Lincoln SE, Lander ES, Tanksley SD Mendelian factors underlying quantitative traits in tomato:comparison across species, generations and environments.Genetics,1991(1).

[8]Abenes MLP, Angeles ER, Khush GS, Huang N Selection of bacterial blight resistant plants in the F2 generation via their linkage to molecular markers. Rice Genet Newsl,1993(10).

[9]McCouch SR, Kochert G, Yu ZH, Wang ZY, Coffiman R, Khush GS, Tanksley SD Molecular mapping of rice chromosomes. Theor Appl Genet,1988(6).

[10]Causse MA, Fulton TM, Cho YG, Ahn SN,Chunwongse J, Wu KS, Xiao JH, Yu ZH, Ronald PC,Harrington SE, Second G, McCouch S, Tanksley SD Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population. Genetics,1994(4).

[11]Yi G, Lee SK, Hong YK, Cho YC, Nam MH, Kim SC,Han SS, Wang GL, Hahn TR, Ronald PC, Jeon JS. Use of Pi5(t) markers in marker-assisted selection to screen for cultivars with resistance to Magnaporthe grisea. Theor Appl Genet,2004(5).

[12]Jia Y. Artificial introgression of a large chromosome fragment around the rice blast resistance gene Pita in backcross progeny and several elite rice cultivars.Heredity (Edinb).,2009(4).

[13]Conaway-Bormans CA, Marchetti MA, Johnson CW,McClung AM, Park WD Molecular markers linked to the blast resistance gene Pi-z in rice for use in markerassisted selection. Theor Appl Genet 2003(6).

[14 ]Jiang J, Mou T, Yu H, Zhou F. Molecular breeding of thermo-sensitive genic male sterile (TGMS) lines of rice for blast resistance using Pi2 gene. Rice (N Y).2015(12).

[15]Ou SH Breeding rice for resistance to blast, a critical view. In: IRRI (ed) Proc Rice Blast Workshop. IRRI,Manila,1979.

[16]陈红旗,陈宗祥,倪深,等.利用分子标记技术聚合3个稻瘟 病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J].中国水稻科学,2008(1).

[17]Wang C, Yang Y, Yuan X, et al. Genome-wide association study of blast resistance in indica rice. BMC Plant Biology,2014(1).

[18]Iles MM. Genome-wide association studies. Methods Mol Biol,2011(713).

[19]Roumen EC A strategy for accumulating genes for partial resistance to blast disease in rice within a conventional breeding program. In: Zeigler RS, Leong S,Teng P (eds) Rice blast disease. CAB International/IRRI,Madison,1994.