基于色谱–光谱联用和斜投影法分析丹皮酚含量*

闫一夫，姚志湘，粟晖，刘柳，李张升，吕金星

(1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州 545006)

丹皮酚药理应用价值广泛，除用于医疗制剂原料外，还用于牙膏、护肤、美容等日化品中。丹皮酚的含量测定是各种制剂和产品质量控制的主要指标之一，中国药典(2005年版)规定以丹皮酚的含量作为检查牡丹皮、徐长卿及六味地黄丸质量的定量指标［1］。2010 年版《中国药典》收载了牡丹皮中丹皮酚的高效液相色谱(HPLC)含量测定法［2］。文献报道了HPLC同时测定牡丹皮中丹皮酚和芍药苷含量的方法［3］，以及近红外光谱分析方法［4-5］，两种方法灵敏度高，但分析成本高，操作强度大，大批量样本的分析效率低，需要建立一种丹皮酚含量快速分析新方法。

光谱组分混合体系定量分析丹皮酚比较困难，一般是通过先分离后定量。姚志湘等［6-7］提出采用“斜投影”作为理论依据，应用于斜投影-不展开薄层法对混合染液进行测定［8-9］，其分析速度快，测定效果理想。

斜投影方法定量分析是先将被测组分的光谱信号从混合光谱中分离，然后进行定量分析。对不同批次丹皮酚结晶母液样品用高效液相色谱-光谱仪联用采集各样品经色谱分离后的紫外光谱数据，经数据处理获得不含被测组分丹皮酚的背景光谱数据H，获得只含有被测组分丹皮酚的光谱数据s，计算标准样品浓度与want值的线性方程［10］，采集紫外光谱数据计算want值代入线性方程，分析待测样本中丹皮酚含量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-20AT型，日本岛津公司；

紫外-可见光纤光谱仪：Maya2000型，美国Ocean Optics公司；

电子分析天平：AL104型，上海梅特勒-托利多公司；

无水乙醇：AR，成都市科龙化工试剂厂；

甲醇、乙腈：色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司；

丹皮酚标准样品：纯度99.9%，广西亿康制药业有限公司；

丹皮酚结晶母液：纯度60%～80%，广西亿康制药业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器工作条件

(1)液相色谱条件。色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm)；流动相：0～30 min，乙腈-水体积比为40∶60，30～55 min，乙腈-水体积比为5∶95，55～80 min，乙腈-水体积比为95∶5；流 量：1 mL／min；进样体积：20 μL；柱温：20℃；色谱检测波长：270 nm。

(2)光谱条件。流动比色皿：1 cm；积分时间：15 μs；积分次数：20次；紫外检测波长：200～400 nm。

1.2.2 丹皮酚标准样品紫外光谱采集

精确称取0.101 0 g丹皮酚标准样品，用75%乙醇定容到100 mL。依次配制质量浓度为2，4，8，12，16，20 mg／L丹皮酚-75%乙醇溶液(编号B1～B6)。采集各溶液200～400 nm紫外光谱(记为a1～a6)。

1.2.3 待测样本的制备及紫外光谱采集

室温下，分别取丹皮酚结晶母液0.15 g左右，上层溶液和下层晶体各一份，用75%乙醇稀释到一定浓度，得到样本S1和S2。

取不同生产批次的丹皮酚结晶母液两份，分别加热至50℃成熔融状态，分别称取1.2 g和0.9 g，用75%乙醇稀释到一定浓度，得到样本S3和S4。

称取丹皮酚结晶产品0.1 g，用75%乙醇稀释到一定浓度，得到样本S5。取S1～S5等体积混合得到样本S6。

在1.2.1(2)仪器条件下，采集S1～S6的紫外光谱数据，得到待测样本数据库，记为D。

1.2.4 数据库的建立

将待测样品S1～S6和丹皮酚标准样品样本B3，通过液相色谱与光谱仪联用，采集各样本经过色谱柱完全分离后的多波长光谱数据。从待测样品光谱数据中扣除待测组分丹皮酚的光谱数据，并经数据降维［11］，得到背景数据库H，仅保留待测组分丹皮酚的光谱数据记为s。

1.2.5 标准样品与对应want值的计算

将上述光谱数据库H，s以及标准样品a1～a6光谱数据导入计算平台MATLAB［12-13］，选取200～400 nm波长段，应用斜投影算法分别计算各标准样品丹皮酚质量浓度对应的want值。

1.3 回收试验

分别取10 mL S2，S4，S5各3份，分别加入8，12，16 mg／L 3个浓度的丹皮酚对照品溶液10 mL，混合均匀后采集其多波长紫外光谱，采用斜投影判据计算丹皮酚的含量，计算该方法的回收率。

2 结果与讨论

2.1 数据库的建立

对丹皮酚标准样品溶液B3和混合样本S6进行分析，色谱图见图1。

图1 丹皮酚母液和丹皮酚对照品的液相色谱图

如图1所示，A为丹皮酚的色谱峰，其出峰时间对应为16.3～17.5 min。从S6的光谱数据中扣除与丹皮酚具有相同保留时间的光谱数据(如图1中A峰数据)，其余数据(B峰数据)则作为测定丹皮酚含量的本底数据，记为M6。依次从样品S1～S5的光谱数据中分别扣除16.3～17.5 min时间段的光谱数据所对应的列后存入本底数据库中，记为M1～M5。合并M1～M6数据构成数据库M。

液相色谱-光谱联用获取的初始本底光谱数据M数据量大，若直接采用，运算时间长，影响了方法的时效性，因此需要对获取的数据进行降维以去除数据中的噪声和冗余的维数，保留有效性数据，提高算法的处理速度。选用主成分分析的方法判断体系主成分为8个，将M经奇异值分解［14］，取降解后U矩阵的前8列，即为降维后的背景数据库H。

从样品S1～S6的光谱数据中分别保留16.3～17.5 min时间段的光谱数据所对应的列后存入数据库中，记为s1～s6。合并s1～s6数据构成数据库s。

2.2 标准样品质量浓度与对应want值的线性关系

按1.2.5计算每个标准样品丹皮酚质量浓度对应的want值。

对标准样品丹皮酚质量浓度y与want值x进行线性回归得到的线性方程y=27.654x-34.253，相关系数r2=0.997 8。

2.3 样品中丹皮酚的测定

根据待测样品样本S1～S5的紫外光谱数据与数据库H，s，按斜投影判据的算法步骤计算丹皮酚的含量对应的want值，代入线性方程计算含量。同时和高效液相色谱计算出的丹皮酚含量值进行比对。各待测样本中的丹皮酚的含量及相对误差列于表1。

表1 两种不同方法测定结果

由表1可以看出，采用斜投影判据计算结果与采用高效液相色谱计算结果相接近。相对误差小于5.0%，说明该方法的准确度较高。

2.4 精密度试验

按1.3方法对样品S2，S4，S5进行精密度试验，结果见表2。

表2 精密度试验结果

由表2可知，测定结果的相对标准偏差为0.4%～1.0%，说明该方法具有良好的精密度。

2.5 回收试验

按1.3进行回收试验，结果见表3。由表3可看出，样品回收率范围为98.8%～101.3%。用斜投影判据计算出来的丹皮酚的含量与实际添加量接近，表明该方法的准确度较好。

表3 回收试验结果

3 结论

通过液相色谱-紫外可见光谱仪联用，应用斜投影判据，建立了丹皮酚含量快速分析方法。对于同类样品的测定，一旦数据库建立好，只需测试待测样品的UV光谱数据即可实现待测样品中物质含量的分析。与高效液相色谱法相比，该方法稳定可靠、操作简便，可以实现丹皮酚样品的即时测量，为丹皮酚含量快速测定提供了一种比较实用的定量分析技术，并可推广应用于其它丹皮酚制品检测领域。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［3］李向阳，屠万倩，张留记. RP-HPLC法测定不同产地的牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量［J］.中药新药与临床药理，2011，22(5): 563-565.

［4］陆婉珍.现代近红外光谱分析技术［M］.2版.北京：中国石化出版社，2007.

［5］张延莹，张金巍，张培，等.近红外光谱技术在丹酚酸B 纯化在线质控中的应用研究［J］.时珍国医国药，2010，21(3): 220.

［6］姚志湘，粟晖.基于子空间重合判断的混合光谱模式识别方法［P］.中国：CN102262054A，2011-11-30.

［7］姚志湘，粟晖.多元统计描述中随机误差与变量空间角的关系［J］.中国科学：化学，2010，40(10): 1 564-1 570.

［8］粟晖，姚志湘，方凤，等.一种染料纯度的快速检测方法［P］.中国：N103954713A，2014-07-30.

［9］葛军，姚志湘，粟晖，等.一种混合染料溶液中组分含量的测定方法［P］.中国：CN103018393A，2013-04-03.

［10］葛军.基于斜投影-不展开薄层定量分析方法的研究［D］.柳州：广西科技大学，2013.

［11］保罗·戈培林.化学计量学实用指南［M］.2版.吴海龙，康超，译.北京：科学出版社，2006.

［12］刘则毅.科学计算技术与Matlab［M］.北京：科学出版社，2001.

［13］冷伍明.基础工程可靠度分析与设计理论［M］.长沙：中南大学出版社，2000.

［14］Jürgen W Einax. Paul Gemperline (Ed.): Practical guide to chemometrics，2nd Ed［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，3 883: 511-512.