无溶剂体系中酶法催化微藻油脂乙酯化制备生物柴油工艺研究

库流鹏，贺珧珈，姚杰，曹海，闫云君

(1.华中科技大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074;2.华中科技大学 中欧清洁与可再生能源学院，湖北 武汉 430074)

为了缓解石油供应和环境污染问题，生物柴油作为一种可再生的生物燃料越来越受到人们青睐。但是，与传统的石油相比，生物柴油的成本偏高，缺乏竞争力。生物柴油制备［1-2］过程中大部分成本来自于原材料。一般地，植物油原料［3］成本达到总成本的80%左右。以微藻为原料制备生物柴油通常被认为能够有效降低成本，因为微藻具有生长周期短、生物产量高和油脂含量高等突出优点［4］。此外，微藻的培养不占用耕地，可在工厂的烟囱甚至公路附近设计用于培养微藻的生物反应器［5］来吸收排放的废气产生油脂，这对于改善环境污染有着积极作用。Chisti［6］通过建立数学模型进行工程计算，得出以微藻为原料制备的生物柴油是传统石化柴油最有潜力的替代品。同时，微藻也是多不饱和脂肪酸的重要来源，多不饱和脂肪酸在营养和医学领域［7］有着重要应用价值。目前，通过鱼油资源获取多不饱和脂肪酸已难以满足人们的庞大需求，开发微藻作为新的资源有着良好的发展前景［8］。

虽然关于微藻的研究近年已成为热点，但关于微藻油脂乙酯化制备生物柴油的研究鲜见报道。本文研究了Novozym 435 脂肪酶［9］催化藻油和乙醇的转酯化技术工艺，并采用Box-Behnken 设计和响应面法对其反应参数进行了优化。反应选取乙醇为酰基受体，因为前期对藻油性质研究发现其与乙醇的互溶性较好，且乙醇可通过生物质发酵生产，是一种清洁可再生、无毒无害的资源，使得工艺过程更为环保。体系中不添加其它有机溶剂［10］，产物生物柴油类型为脂肪酸乙酯，也能用于多不饱和脂肪酸富集等高值化过程。本文探索了微藻生物柴油的制备条件，同时为其高值化应用奠定了技术基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

固定化Novozym 435 脂肪酶，购自丹麦诺维信公司;藻油，购自本地市场，其脂肪酸组成见表1;脂肪酸乙酯标准品均为色谱纯;无水乙醇、正己烷等均为分析纯。

表1 藻油的脂肪酸组成Table 1 Composition of the microalgae oil

AL104 型电子天平;UPT-IV-10T 纯水仪;HPINNOWAX19091-133 型气相色谱柱;GC9790 型气相色谱仪;WY211B 恒温摇床;ULT1786-3-V39 超低温冰箱;5415D 型离心机;Vortex-2 漩涡振荡仪。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验 单因素实验中主要考察了加酶量、反应时间、醇油摩尔比、反应温度和转速等因素对于脂肪酸乙酯得率的影响。称取藻油5.0 g 于25 mL 的磨口三角瓶中，按照一定的比例加入无水乙醇，通N2保护，盖上塞子密封后置于恒温摇床中混合均匀，加入一定量的脂肪酶，继续置于恒温摇床中振荡反应一定时间。所有实验均设3 次平行实验。

1.2.2 响应面实验 根据单因素实验的结果，选定酶用量、反应时间、醇油摩尔比和温度4 个因素，采用Box-Behnken 法设计4 因素3 水平的响应面实验进行进一步优化，所有实验均进行3 次平行实验。实验所得数据用统计学软件SAS 9.2 进行分析，拟合出回归模型的二次方程并进行方差分析，根据得到最优的预测工艺条件进行验证实验。回归模型如下:

1.2.3 乙酯得率计算 取100 μL 反应液离心，取10 μL 上层清液，加入290 μL 十七烷酸甲酯内标，再加入300 μL 正己烷混合均匀后用于气相色谱分析。气相色谱柱:HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm);载气N2，柱流速2 mL/min，尾吹气体流速30 mL/min，分流比30∶1，柱温230 ℃，检测器温度280 ℃，进样量1 μL，升温程序为200 ℃保持1 min，以3 ℃/min 升至240 ℃，保持10 min。乙酯得率的计算公式如下:

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 Novozym 435 脂肪酶用量对乙酯得率的影响在反应温度40 ℃，乙醇和藻油摩尔比3∶1，转速200 r/min，反应时间12 h 的条件下，考察了加酶量基于油质量在2% ～8%范围内对生物柴油得率的影响，结果见图1。

图1 脂肪酶用量对乙酯得率的影响Fig.1 The effect of enzyme dosage on FAEE yield

由图1 可知，当加酶量从2%上升到5%时，乙酯得率呈上升趋势;当加酶量超过5%时，乙酯得率不再上升［11］，甚至略微下降。可能原因是，在一定的范围内加入酶量越大，酶与底物的接触越充分，越有利于反应的进行;当加酶量增加到一定程度时，酶相对于底物达到饱和，所以再增加酶量不能提高转化率。另外，酶量过大时容易发生团聚，不利于酶与底物的接触，反而会使转化率下降。因此，最佳加酶量选定为5%。

2.1.2 反应时间对乙酯得率的影响 在加酶量5%，乙醇和藻油摩尔比3∶1，反应温度40 ℃，转速200 r/min 的条件下，测定了不同反应时间下的乙酯得率，结果见图2。

由图2 可知，在0 ～16 h 反应速率随着时间的增加而逐渐下降，16 h 后反应达到平衡，转化率也达到最大，且保持不变，符合酶催化反应固有规律［12］。因此，最佳反应时间设定为16 h。

图2 反应时间对乙酯得率的影响Fig.2 The effect of reaction time on FAEE yield

2.1.3 醇油摩尔比对乙酯得率的影响 理论上，酯交换反应的醇油摩尔比为3∶1。但酯交换反应为可逆反应，过量的乙醇会促进反应正向进行，从而增加乙酯得率。因此，在加酶量5%，反应时间16 h，反应温度40 ℃，转速200 r/min 条件下，研究了醇油摩尔比在2∶1 ～6∶1 范围内对乙酯得率的影响，结果见图3。

图3 醇油摩尔比对乙酯得率的影响Fig.3 The effect of molar ratio of ethanol to oil on FAEE yield

由图3 可知，在醇油摩尔比为4∶1 时乙酯得率最高，当醇油摩尔比高于4∶1 时，乙醇对酶开始显现毒害作用，不利于转酯反应的进行。因此，最佳醇油摩尔比选定为4∶1。

2.1.4 转速对乙酯得率的影响 在加酶量5%，反应时间16 h，反应温度40 ℃，醇油摩尔比4∶1 的条件下，检测了不同摇床转速条件下的乙酯得率，结果见图4。

由图4 可知，在100 ～200 r/min 转速范围内，乙酯得率随转速的增加而提高，这是因为增加转速有利于反应底物充分混合。在转速200 ～300 r/min范围内，乙酯得率基本不受转速的影响。考虑到增加转速会加大摇床功率，且过高转速可能会损伤固定化酶结构从而减少其使用寿命，因此最佳转速设定为200 r/min。

图4 转速对乙酯得率的影响Fig.4 The effect of rotating speed on FAEE yield

2.1.5 反应温度对乙酯得率的影响 酶催化反应都有最适的催化温度，为了确定本反应的最适温度，在加酶量5%，反应时间16 h，醇油摩尔比4∶1，转速200 r/min 的条件下，考察了在25 ～55 ℃范围内乙酯得率随温度变化情况，结果见图5。

图5 反应温度对乙酯得率的影响Fig.5 The effect of reaction temperature on FAEE yield

由图5 可知，该反应的最适温度为45 ℃，升高或降低温度都会使酶的活性下降，不利于反应进行。当温度较低时，乙醇和藻油互溶性不好，增加了传质阻力，也会对反应造成不利影响。因此，最佳反应温度选定为45 ℃。

2.2 Box-Behnken 设计实验及其结果分析

Box-Behnken 设计的因素及水平见表2，得到的响应面实验结果见表3。

表2 单因素及其水平Table 2 Independent variables and levels

得到的数据经SAS 9.2 软件分析，得到二次回归方程如下:

表3 Box-Behnken 实验结果Table 3 Result of Box-Behnken experiments

模型的可靠性依据表3 得到的数据进行方差分析。

由表4 可知，在a=0.05 的水平上，模型的P 检验值＜0.000 1，表明该回归模型是高度显著的。失拟项的P 检验值为0.196 9，表明相对于纯误差的影响，失拟项的影响是不显著的。该模型的决定系数R2=0.981 9，表明98.19%的乙酯得率都可以用这个模型预测，说明该模型预测酶催化转酯反应很准确。

表4 回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model

根据SAS 9.2 预测得到的回归方程各项系数见表5。

表5 回归模型的回归系数分析Table 5 Regression coefficient of predicted quadratic polynomial model

由表5 可知，X1(加酶量)、X2(反应时间)和X3(醇油摩尔比)3 个因素的系数均＜0.05，表明这3个因素都对该反应有显著的影响，影响程度为X1(加酶量)＞X2(反应时间)＞X3(醇油摩尔比)。X4(温度)的系数为0.064 5 ＞0.05，表明相对于其它几个因素，在选定温度范围内酶的活性都能保持较高，对于反应影响较小。酶用量对于反应的影响程度最大，且它对反应表现为正向影响。在交叉项中，X1X3的系数最小，表明它对反应影响程度最大且为正向影响，也就是说，同时增加酶用量和醇油摩尔比乙酯的得率会提高。在平方项中，的系数最小，说明乙醇加入量对于反应有着重要影响。

图6 各组交叉因素对乙酯得率的影响Fig.6 The effect of cross-cutting factors in each group on FAEE yieid

由响应面图6 可知，同时增加醇油摩尔比和减少酶用量会使得乙酯得率大大下降，可能的原因是过量乙醇对酶有毒害作用，如果同时减少酶用量会使得大部分的酶失活，乙酯得率也就下降;同时升高温度和增加酶用量也会使乙酯得率下降，可能原因是过高的温度易使酶失活，过量的酶易聚集，这都会降低酶的催化活性从而使得率下降;温度和醇油摩尔比的交叉影响对于反应来说不显著，但改变其中任何一个因素都会使得得率有所下降。

2.3 模型验证

根据图6 中的响应面可知，该回归模型具有稳定点。通过回归模型分析预测的最优条件为:加酶量6.0%，醇油摩尔比4.0∶1，温度44.7 ℃，反应时间17.6 h，乙酯得率为94.35%。根据预测的最优条件，结合实际情况进行了3 次平行实验，得到乙酯的平均得率为94.86%，与预测值极为接近，表明在选定范围内该模型能够很好地预测酶催化微藻油脂乙酯化反应，该响应面模型有效。

3 结论

研究了无溶剂体系中微藻油脂的酶法乙酯化技术工艺，通过单因素实验和Box-Behnken 设计的响应面优化工艺参数，得出酶法催化藻油乙酯化最优条件为:固定化Novozym 435 脂肪酶加酶量6.0%，醇油摩尔比4.0∶1，温度44.7 ℃，反应时间17.6 h，在该条件下生物柴油得率达94.86%。同时，较高的乙酯转化率为从藻油提取不饱和脂肪酸奠定了良好技术基础。

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