长柄侧耳发酵产物对荷H22肝腹水瘤小鼠免疫功能影响及抗肿瘤作用研究*

邓西贝，周 贤，李爱欣，张 楠，翁丽丽，王淑敏

（长春中医药大学药学院，吉林 长春 130012）

长柄侧耳发酵产物对荷H22肝腹水瘤小鼠免疫功能影响及抗肿瘤作用研究*

邓西贝，周 贤，李爱欣，张 楠，翁丽丽，王淑敏**

（长春中医药大学药学院，吉林 长春 130012）

研究长柄侧耳发酵产物对荷H22肝腹水瘤小鼠机体免疫力和抗肿瘤作用的影响。将小鼠除阳性药组外连续灌胃给药6 d，在第7天给每只小鼠右前肢腋下接种H22肝腹水瘤悬液。14 d后，测定血清中白细胞介素2（IL-2）和免疫球蛋白G（IgG）的含量，计算胸腺指数和抑瘤率，测定T、B细胞增殖能力。研究结果表明，发酵液和菌丝各剂量组与模型组相比均能显著提高小鼠的胸腺指数（p＜0.01）、T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力（p＜0.01）以及血清中IgG和IL-2的含量（p＜0.01）。长柄侧耳发酵产物能够提高荷瘤小鼠的免疫力，并对肿瘤具有一定的抑制作用。

长柄侧耳；白介素；免疫球蛋白；淋巴细胞

长柄侧耳（Pleurtus spodotecus Fr.） 属伞菌目、侧耳科、侧耳属的一种食（药）用真菌。据文献报道子实体的水提液对小鼠抑瘤率为72%[1]。近年来癌症发病率有逐年升高的趋势，传统的癌症治疗方法因副作用大，过程痛苦，费用高昂，常常给癌症患者带来极大的生活负担和身体损伤，因此，毒副作用相对较小的中药在癌症治疗领域日渐受到关注。大量报道表明，药用真菌具有抗癌作用[2]，且在治疗过程中少见毒副作用，还可以对传统放化疗治疗方法中出现的毒副作用起到辅助治疗。本文主要研究长柄侧耳发酵液和菌丝对荷H22腹水瘤小鼠免疫功能的影响及其抗肿瘤作用。

1 实验材料

1.1试药的制备

长柄侧耳发酵液样品制备：分别准确称取长柄侧耳发酵液干粉20 g、10 g、5 g，分别放于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，充分溶解，即得发酵液样品。长柄侧耳菌丝样品制备：分别准确称取长柄侧耳干燥菌丝20 g、10 g、5 g，加水煎煮2次，每次1 h，过滤，合并滤液，定容至50 mL容量瓶中，即得菌丝样品。

1.2实验试剂

阳性药CTX（环磷酰胺），上海华联制药有限公司；小鼠白细胞介素-2（IL-2）酶联试剂盒与小鼠免疫球蛋白（IgG）酶联试剂盒，长春百金生物科技股份公司；刀豆蛋白和脂多糖，上海试剂厂；小牛血清，上海立菲生物技术有限公司；二甲基亚砜，天津市凯利达化工贸易有限公司；Hank’s液（配制）、MTT试液（配制）、RPMI1640培养液。

1.3实验仪器

酶标分析仪，Rayto RT-6000；分析天平，日本岛津AUY220；台式低速冷冻离心机，aida公司TDL5M；5%CO2细胞培养箱，HeRA公司XB-K-25；光学显微镜，Olympus CX21FS1；高压蒸汽灭菌锅LDZX-50KB，上海申安医疗器械厂；96孔细胞板、酶标板（美国Costar）、小鼠灌胃器、2 mL医用注射器、小鼠手术器械。

1.4实验动物

健康昆明小鼠，体重18 g～22 g，雌雄各半，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1动物分组及给药方案

健康昆明小鼠80只，体重18 g～22 g，实验前先将小鼠适应性饲养1周，然后随机分为8组，每组10只，雌雄各半，分别为模型对照组、阳性对照组（环磷酰胺）、长柄侧耳发酵液高剂量组（4 g·kg-1）、中剂量组（2 g·kg-1）、低剂量组（1 g·kg-1）、长柄侧耳菌丝高剂量组（4 g·kg-1）、中剂量组（2 g·kg-1）、低剂量组（1 g·kg-1）。各组小鼠均自由进食饮水，每3天称一次体重，按照小鼠的体重灌胃给药（0.2 mL/10g）。具体方案见表1。

表1 实验方案Tab.1 Experimental scheme

2.2小鼠实体瘤模型的建立

除阳性对照组外，各组小鼠连续灌胃给药6 d。于第7天选择接种H22肝腹水瘤7 d～10 d的瘤源小鼠，脱臼处死，取腹水制作浓度为1×107个·mL-1的瘤细胞液，每只小鼠右前肢腋下皮下注射0.2 mL。接瘤后，阳性对照组灌胃给药CTX（环磷酰胺）0.1 g·kg-1；模型对照组灌胃给药生理盐水；其余各组按表1给药，每天1次，连续14 d。

2.3指标测定

2.3.1 免疫器官质量及肿瘤指数的测定

连续给药14 d后，小鼠摘眼球取血后处死，无菌条件下取出胸腺及肿瘤块，用生理盐水冲净血污，滤纸吸干，精密称量胸腺和肿瘤块的重量，计算胸腺指数、肿瘤指数和肿瘤抑制率，胸腺指数（I，mg·g-1）、肿瘤抑制率（P）公式分别为：

I=m1/m

P=（M-M0）/M×100%

式中：m1表示胸腺重量；m表示体重；M表示模型

组平均瘤重；M0表示给药组平均瘤重。

2.3.2 淋巴细胞增殖指数的测定

按照2.3.1处死的小鼠，在无菌条件下取出脾脏，用PBS液冲洗3遍，剪碎研磨，以5 mL Hank’s液制成脾细胞悬浮液，于无菌离心管中，1 500 r·min-1离心15 min。离心后，再用Hank’s液洗涤2次，弃去上清液，加入RPMI1640培养液，在显微镜下，调整脾细胞浓度至5×106个·mL-1。将脾细胞混悬液加入96孔细胞培养板，每孔100 μL，每个样本设9个重复孔，其中3孔加ConA（终浓度5 μg·mL-1），3孔加脂多糖（终浓度为10 μg·mL-1） 各100 μL，另外3孔用完全RPMI-1640培养液100 μL做空白对照。置5%CO2培养箱培养68 h，取出培养板，加入MTT（5 μg·mL-1）10 μL·孔-1，继续培养6 h。结束后，1 000 r·min-1离心10 min，每孔取出100 μL上清液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，充分震荡，37℃放置过夜，酶标仪570 nm处测定OD值。根据OD值计算T细胞增殖指数（IT）和B细胞增殖指数（IB），公式如下：

IT(IB)=OD1(λ)/OD2(λ)

式中：OD1表示实验孔（Test hole）OD值；OD2表示对照孔（Comparing hole）OD值。

2.3.3 血清免疫因子含量的测定

小鼠摘眼球取血后，离心分离血清，根据相应的试剂盒说明书，测定白细胞介素2（IL-2）和免疫球蛋白G（IgG）的含量。

2.4数据处理

3 实验结果

3.1不同剂量对免疫器官及肿瘤形成的影响

小鼠胸腺指数及抑瘤率测定结果见表2。

表2 小鼠胸腺指数及抑瘤率Tab.2 Mice thymus indicator and antitumor rate

由表2可知，与模型对照组相比，长柄侧耳发酵液和菌丝各剂量组均能显著提高小鼠的胸腺指数（p<0.01），具有统计学意义，说明以长柄侧耳发酵液和菌丝灌胃给药能提高小鼠的免疫力。其中长柄侧耳发酵液高剂量组（4 g·kg-1）胸腺指数最高；抑制肿瘤方面以长柄侧耳菌丝低剂量组（1 g·kg-1）效果最好，对肿瘤的抑制率可达46.46%。

3.2不同剂量对淋巴细胞增殖反应的影响

T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖指数见表3。

由表3可知，与模型对照组相比，长柄侧耳发酵液高、中剂量组和菌丝高、低剂量组小鼠T淋巴细胞的增殖能力均显著提高（p<0.01或p<0.05），具有统计学意义。阳性对照组、发酵液各组和菌丝高剂量组小鼠B淋巴细胞的增殖能力均显著提高（p< 0.01或p<0.05），说明以长柄侧耳发酵液和菌丝可以提高小鼠T细胞和B细胞的增值能力，其中发酵液高剂量组（4 g·kg-1）小鼠细胞增殖能力最强。

3.3测定结果对血清免疫因子的影响

血清中IgG和IL-2的含量情况见表4。

表3 T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖指数Tab.3 Proliferation indicator of T cell and B cell

表4 血清中IgG和IL-2的含量Tab.4 Content of IgG and IL-2 in serum

由表4可知，长柄侧耳发酵液和菌丝各组均能显著提高小鼠血清中IgG和IL-2的含量（p<0.01），具有统计学意义，其中菌丝高剂量组（4 g·kg-1）中IgG含量最高，发酵液高剂量组（4 g·kg-1）中IL-2含量最高。

4 讨论

肿瘤的产生和发展常常伴随着机体免疫系统破坏或者免疫力降低，当机体免疫力下降时，罹患癌症几率会显著升高，因此通过提高免疫力，可以更好地预防、抑制肿瘤的发生[3-5]。

胸腺是重要的中枢免疫器官，是T细胞分化成熟的主要器官，若胸腺发生萎缩，表示机体的免疫系统受到抑制，免疫力降低，相反若胸腺指数增加，则可表明机体免疫力得到提升。将长柄侧耳发酵液和菌丝给药荷瘤小鼠后，均能显著提高小鼠的胸腺指数，说明长柄侧耳发酵液和菌丝均能提高荷瘤小鼠的免疫力。

脾脏是重要的外周免疫器官，承载着大量的免疫细胞，如T细胞、B细胞等。T细胞是一类免疫调节细胞，由胸腺产生，表达IL-10等免疫抑制因子，细胞表面表达IL-2受体Ot链（CD25），本身不产生IL-2，T细胞主要是通过细胞——细胞接触依赖方式发挥免疫抑制作用，在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用[6]。B细胞可对抗原进行识别，经活化、增殖后分泌出抗体，参与体液免疫。这两种细胞的增殖能力可直接反应出机体免疫力的高低。实验采用ConA和LPS对小鼠脾脏中的T细胞和B细胞进行刺激，测定其增殖能力，发现给予长柄侧耳发酵液和菌丝的小鼠T细胞和B细胞的增殖能力均显著提高，再次印证了长柄侧耳发酵液和菌丝具有提高荷瘤小鼠免疫力的功效。

白细胞介素-2，也称T细胞生长因子，能促进所有T细胞的分化成熟，同时对B细胞的活化增殖也有促进作用。免疫球蛋白G能够对机体的免疫系统起到防护作用。这两种物质在体内含量的高低可以直接影响机体免疫力的高低。研究结果发现，给予长柄侧耳发酵液和菌丝提取物的小鼠血清中免疫球蛋白G和白介素-2的含量均显著提高，同样也证明了长柄侧耳发酵液和菌丝能够提高荷瘤小鼠的免疫力。

不同剂量对接种了H22肝腹水瘤的小鼠灌胃给药长柄侧耳发酵液和菌丝，可在一定程度上抑制肿瘤的发展，其中以菌丝低剂量组抑瘤效果最好，抑瘤率达到46.46%。

综上所述，免疫治疗的目的是刺激机体产生更多的具有肿瘤特异性和细胞毒性的T细胞、B细胞和多种免疫应答因子，从而特异性地攻击肿瘤细胞[7-8]。长柄侧耳发酵产物能够提高荷瘤小鼠的免疫力，并且对H22腹水瘤具有一定的抑制功效，这为进一步研究和开发长柄侧耳提供了依据。可以考虑将长柄侧耳发酵产物开发成与提高免疫力相关的保健品，或是对肿瘤治疗起辅助作用的药品。

[1]李如光.吉林省真菌志 [M].长春：东北师范大学出版社，1991.

[2]余飞龙,项建霞.香菇多糖：联合化疗治疗恶性肿瘤42例[J].肿瘤学杂志，2001，7（2）：119.

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[4]张大鹏，赵雅.中药多糖免疫调节作用研究进展 [J].临床医学工程，2012，19（8）：1423-1424.

[5]王思芦，汪开毓，陈德芳.食用真菌多糖免疫调节作用及其机制研究进展[J].动物医学进展，2012，33（11）：104 -108.

[6]Rudge G,Gleeson PA,Vall Driel IR.Control of immune respon-ses by immunoregnlatory T cells[J].Arch Immunol TherExp(Warsz),2006,54（6）:381-391.

[7]Figdor CG,de Vries IJ,Lesterhuis WJ,et al.Dendritic cell immunotherapy:mapping the way[J].Nat Med,2004,10（5）:475.

[8]Goddard RV,Prentice AG,Copplestone JA,et al.Generation in vitro of B-cell chronic lymphocytic leukaemia-proliferative and specific HLA class—restricted cytotoxic T cell responses using autologous dendritic cells pulsed withtumour cell lysate [J].Clin Exp Immunol,2001,126（1）:16.

草菇是糖尿病患者的良好食品

草菇的维生素C含量高，能促进人体新陈代谢，提高机体免疫力，增强抗病能力。它还具有解毒作用，如铅、砷、苯进入人体时，可与其结合，形成抗坏血元，随小便排出。

草菇蛋白质中，人体8种必需氨基酸整齐，含量高，占氨基酸总量的38.2%。草菇还含有一种异种蛋白物质，有消灭人体癌细胞的作用。所含粗蛋白含量超过香菇，其他营养成分与木质类食用菌也大体相当，同样具有抑制癌细胞生长的作用，特别是对消化道肿瘤有辅助治疗作用，能加强肝肾的活力。同时能够减慢人体对碳水化合物的吸收，是糖尿病患者的良好食品。

中国食用菌商务网 2015.01.27

Research on the Influence of Pleurotus spodoleucas Zymotic Product on Organism Immunity and Antitumor Effect of H22 Hepatoma Bearing Mice

DENG Xi-bei,ZHOU Xian,LI Ai-xin,ZHANG Nan,WENG Li-li,WANG Shu-min
(College of Pharmacy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130012,China)

The influence of Pleurotus spodoleucas Fr.fermentation product on organism immunity and antitumor effect of H22 hepatoma bearing mice were studied.The medicine were administered to mice except the positive medicine group continuously for 6 days,and H22 hepatoma suspension were inoculated to the right forelimb armpit of each mouse on 7th day.After 14 days, the content of IL-2 and IgG in serum and T,B cell proliferation capacity were determined,and thymus index and tumor inhibition rate were calculated.Compared with model group,zymotic fluid and hypha distinct dose groups could obviously increase mouse thymus index (p＜0.01),T lymphocyte and B lymphocyte proliferation capacity (p＜0.01)and IgG and IL-2 content in serum(p＜0.01).Pleurotus spodoleucas Fr.fermentation product could increase immunity of hepatoma bearing mouse,while possesses certain inhibiting effect on tumor.

Pleurotus spodoleucas Fr.;interleukin;immunoglobulins;iymphocytes.

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0052-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.014

吉林省科技厅项目（201205050）。

邓西贝（1986-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为中药生物技术。E-mail:564757205@qq.com

**通信作者：王淑敏（1965-），女，博士，教授，主要从事中药生物技术方面研究。E-mail:446097156@qq.com

2014-12-23