三种脱水程序在肾穿刺活检标本制片中的应用比较

韩福兰 ，汪家文 ，刘 靖 ，刘应时 ，刘 芳 *

（1.佛山市中医院病理科，广东佛山528000；2.佛山科学技术学院基础医学部，广东佛山528000）

肾小球肾炎是临床常见病，肾穿刺活检有利其病理分型，以及确定其病变程度，被认为是该病诊断的金标准。肾穿刺组织制片质量的好坏直接影响其病理诊断，因此，提高肾活检标本的制作技术至关重要［1］。肾穿刺组织脱水处理在肾组织标本制作的所有步骤中十分关键，它影响到之后的每一个环节［2］。在长期的实践过程中，对肾穿组织标本脱水方法进行比较，通过对肾穿组织用Bouin固定液进行特殊的固定和选择单独的小标本快速脱水程序，总结出一种既简单又省时实用的组织固定和脱水方法，在肾穿刺活检标本制片中取得了很好的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

收集佛山市中医院2014年1-12月肾内科送检的肾小球肾炎患者肾穿刺组织标本80例，每例穿刺标本分别取3份新鲜组织，取材后固定。

1.2 仪器与设备

YCL-2超声组织处理仪；Thermo全自动真空组织脱水机；SAKURA石蜡包埋机；Leica RM2235型轮转式切片机；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱；Thermo半自动组织脱水机。

1.3 试剂

Bouin固定液、75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，BT生物环保处理剂，BT生物环保透明剂，苏木素，伊红，各种特殊染色试剂，中性树胶。

1.4 方法

1.4.1 组织脱水处理

随机选取B超引导下获得的肾穿刺标本80例，每一例穿刺组织均取3等份新鲜组织，取材后分为A、B、C 3组，均用Bouin液固定。A组为新型超声结合水浴加温组；B组为常规脱水组；C组为小标本单独脱水组。A组处理程序：55℃BT环保处理剂2缸，超声振动并加热各处理20 min；55℃BT环保透明剂2缸，超声振动并加热各处理10 min；54～56℃石蜡20 min。B组处理程序：80%乙醇1缸40 min、90%乙醇3缸各40 min，100%乙醇2缸各60 min，二甲苯2缸各40 min，软蜡1缸40 min，硬蜡1缸60 min。C组处理程序：75%乙醇6 min，80%乙醇6 min，95%乙醇2缸各8 min，无水乙醇2缸各10 min，BT生物环保透明剂2缸各15 min，软蜡30 min，硬蜡30 min。3组均进行石蜡包埋切片。

1.4.2 组织切片和染色

3种处理程序所做的切片均按常规进行HE染色、特殊染色。特殊染色Masson三色法观察免疫复合物、纤维蛋白等，六胺银法（PASM法）显示肾小球基底膜和系膜基质以及IV胶原纤维，过碘酸雪夫染色法（PAS法）观察肾小球和肾小管的基底膜以及增生的系膜基质等细胞外基质情况。

1.5 切片评估指标

采取双盲阅片，根据《临床技术操作规范（病理学分册）》切片质量标准判断甲级和乙级片［3］，其中重点对切片厚度、染色满意度、细胞对比度指标进行质控评价。

2 结果

A组新型超声结合水浴加温组，由于加温快速脱水导致组织收缩明显，组织及细胞形态不清晰、细胞间挤压变形、出现皱缩等现象。B组常规大体标本脱水组，组织变脆易碎、切片较厚、组织及细胞皱缩明显等缺点。

C组小标本单独脱水组制片中，组织蜡块硬度适中，易切片，HE染色细胞着色均匀，核浆染色分明，对比清晰，透明度好。肾小球毛细血管袢及周围结构清晰，细胞间无挤压变形现象，皱折少见，符合优质HE染色要求。特殊染色中，可以很好地显示组织内相应成分，如Masson三色染色法将胶原纤维显示为蓝色，肌纤维为红色，细胞核为黑褐色；PASM法显示肾小球基底膜呈黑色；PAS法显示肾小球内中性粘多糖呈红色，苏木素复染细胞核呈蓝色，如图1～4所示。

在3组处理方法中，C组的切片优良率大大高于A、B组。

图1 肾活检组织3种脱水程序HE染色方法效果比较

图2 肾活检组织3种脱水程序Masson染色方法效果比较

图3 肾活检组织3种脱水程序PASM染色方法效果比较

图4 肾活检组织3种脱水程序PAS染色方法效果比较

3 讨论

在病理制片过程中，组织的前期处理十分重要，对制片效果影响很大。特别是细长的穿刺组织，首先要及时固定标本，以防止细胞变形甚至溶解破坏。福尔马林是最常用的固定剂，但不能使白蛋白及核蛋白沉淀，只能与蛋白质化合起到固定的作用，从而影响到肾穿组织特殊染色的效果［2］。经过长期实践发现，Bouin固定液对肾穿刺组织的固定更理想。Bouin固定液具有保存性能良好，渗透速度快，穿透力迅速，很少引起组织收缩，不会使组织变硬和变脆，且可以保持组织柔韧性等优点［4］。同时该固定液对蛋白质核酸有较好的固定作用，适用于结缔组织染色，尤其是Masson三色染色更为理想。Bouin液必须保持pH为7.0，偏酸、偏碱时容易使肾穿组织在染色时着色不佳［5］，所以对肾穿组织活检标本取材后应立即用Bouin液固定1～2 h，尽量使组织与活体状态结构相似，以便在显微镜下易于观察。

选取最佳的脱水程序，是制作优良切片的重要步骤之一。肾穿刺组织属于小鲜嫩组织标本，对脱水程序的选择非常重要［6］。脱水过程中的梯度酒精具有很强的穿透力，脱水十分迅速，容易使细嫩组织收缩，因此要确保脱水时间在控制范围内［7］。但是脱水时间太短也不好，因为易导致脱水不充分，二甲苯对组织中残留水分的置换不够，导致石蜡浸入不足，使得组织太软或自溶，影响切片［8］。另外，即使脱水到位，透明和浸蜡时间过长会让组织的柔韧性丧失，影响制片［9］。

对于最佳脱水程序的选择及其对制片质量影响方面的研究已有不少。曾敏采用超声波结合水浴加温及应用BT生物组织透明剂代替二甲苯的方法，探讨乙型病毒性肝炎患者肝穿刺组织最合适的脱水程序，发现5～10 min组最合适［10］。方志明等研究认为，使用AAF固定液，结合抽气减压脱水法，可以制作出优质肺组织石蜡切片［11］。薛晓伟等研究发现，异丙醇作为一种组织透明剂，可替代二甲苯，应用于小标本快速脱水，提高制片质量［12］。杨军采用无毒的化学试剂乙醇等代替甲醛和二甲苯处理标本，发现制作的切片着色均匀，红蓝对比明显［13］。王晓鸿等不用OCT包埋剂，而改用普通胶水行冰冻切片用以制作直接免疫荧光染色，探讨人及实验动物肺、肝、肾组织制作免疫荧光及石蜡HE切片的最佳方法，但其未考虑最佳脱水程序的选择问题［14］。目前，关于肾穿刺活检标本制片中最佳脱水程序科学筛选方面的研究报道很少，尤其肾穿组织用Bouin固定液进行特殊固定和选择单独的小标本快速脱水程序进行脱水的方法未见报道［13-14］。

本研究的A组新型超声快速处理技术结合水浴加温脱水程序，主要原理是利用超声波高速震荡，结合加温条件，促进分子运动加速，以加强试剂的穿透作用，脱水、透明、浸蜡过程缩短而加快制片速度［7］。但是，由于肾穿组织比较细小，各种试剂在加温55℃条件下快速脱水、透明、浸蜡，易导致肾穿组织强烈收缩，造成切片困难或厚薄不均，染色后镜下肾小球收缩、结构模糊不清，影响诊断。B组为常规石蜡脱水程序，由于该脱水程序的设置时间较长，特别是在无水乙醇和二甲苯中脱水及透明时间太长（超过3 h），这样大、小标本集中脱水会给肾穿刺标本处理带来一定的风险，易使肾组织变硬、变脆，包埋时易碎，切片较厚或难以切出完整组织切片，镜下组织形态不清晰，细胞间易挤压变形，切片皱折较多等现象［15］。C组小标本组使用半自动脱水机设置，把整个脱水时间、透明时间、浸蜡总时间分别设置为不超过2.5 h、不超过30 min、不超过60 min。同时脱水试剂的浓度也按从低到高梯度循序渐进。另一方面，利用BT生物透明剂代替二甲苯来进行透明。BT生物透明剂主要以醇类为稀释剂，试剂环保，是一种具有独特优势的新型生物组织透明剂，具有与乙醇和石蜡易混合的性质，对组织透明效果好，对组织的收缩作用比二甲苯明显要弱［16］。组织透明时用2缸透明剂分别作用15 min，总时间只要不超过30 min，对肾组织的收缩作用很轻微，能很好地保存组织细胞的结构，更有利于肾穿组织的透明。经此程序处理的肾组织蜡块软硬度适中，容易连续切片，制作的HE染色及特殊染色切片，镜下观察肾小球结构完好，细胞核、浆染色分明，组织细胞结构和其它组织成分显示良好，如特殊染色后肾小球内的网状纤维、胶原、基底膜等［17］。

临床上，急进性肾小球肾炎的肾活检越早越好。明确诊断后的强化治疗可使患者的病情得到显著改善。但是，既往的肾活检从送检到制片完成耗时较长，制片质量不够高，影响到该类疾病的诊疗效果。经过大量实践，应用改良的小标本单独脱水程序，同时用BT环保生物透明剂代替二甲苯透明方法处理肾穿刺组织，所制切片质量好，完全能满足肾穿组织临床病理诊断的需要，质量明显优于其余2组。此方法既简单、省时又环保，肾穿刺组织标本制片可1天完成，从而缩短了发报告的时间，对医师快速正确做出病理诊断，指导治疗及判断预后具有重要意义，大大提高工作效率。

［1］邹万忠.肾脏病理与临床.长沙:湖南科学技术出版社,1997:7.

［2］刘畅,杨琪,何志军.肾穿刺病理制片中特殊染色的问题及对策［J］.诊断病理学杂志,2014,21（5）:313-315.

［3］中华医学会病理学分会组织.临床技术操作规范:病理学分册［M］.北京:人民军医出版社,2004:6.

［4］COSTA PM,COSTA M H.Development and application of a novel histological multichrome technique for clam histopathology［J］.Journal of Invertebrate Pathology,2012,110（3）:411-414.

［5］邹万忠.肾活检病理学［M］.北京:北京大学医学出版社,2006.

［6］李孜孜,王晓鸿,郑燕璇,等.病理试验室细小质嫩穿刺组织脱水处理的方法及探讨［J］.中国实用医药杂志,2011,23（6）:32-33.

［7］MITCHELL A,SULLIVAN,LIShihan,et al.A rapid extraction method for glycogen from formalin-fixed liver［J］.Carbohydrate Polymers,2015,118（15）:9-15.

［8］MILLERA D C,SHAHD R B,BRUHN A,et al.Trends in the Use of Gross and Frozen Section Pathological Consultations During Partial or Radical Nephrectomy for Renal Cell Carcinoma［J］.The Journal of Urology,2008,179（2）:461-467.

［9］傅春燕,冯德云,杨晓静,等.浅谈HE制片中组织固定脱水不佳的补救措施［J］.中国现代医学杂志,2005,15（15）:2370-2380.

［10］曾敏.不同脱水程序在乙型病毒性肝炎患者肝穿刺组织中应用的比较［J］.右江民族医学院学报,2013,35（5）:608-609.

［11］方志明,尹洪萍,袁红.肺组织石蜡切片技术的改良［J］.杭州师范学院学报:自然科学版,2005,4（6）:477-478.

［12］薛晓伟,李星奇,王德田,等.异丙醇替代二甲苯在快速脱水程序中的应用［J］.诊断病理学杂志,2014,21（2）:128.

［13］杨军.组织标本处理的经济环保流程［J］.中国组织工程研究与临床康复,2008,12（46）:9015-9017.

［14］王晓鸿,孟晓军,郑燕璇,等.人体活检穿刺组织、实验动物组织荧光制片、HE制片中的技术改进［J］.中国实用医药,2011,14:222-223.

［15］梁英杰,罗灿峤,林汉良.新型超声组织处理仪在病理快速石蜡制片技术中的应用［J］.现代医学仪器与应用杂志,2008,20（3）:31-32.

［16］梁英杰,罗灿峤,董愉,等.新型生物组织透明剂代替二甲苯在病理制片技术中的应用研究［J］.临床医学工程杂志,2009,16（3）:58-59.

［17］王永军,王肖肖,吕菲,等.环保透明剂在常规组织制片中的应用［J］.临床与实验病理学杂志,2014,30（3）:336-337.