大白菜2个DH系群体遗传多样性分析

梁宝萍，宋佳静，原玉香，张晓伟*，姚秋菊，张 强，赵艳艳

(1.驻马店市农科院，河南驻马店463000;2.河南省农业科学院园艺研究所，河南郑州450008)

大白菜是我国栽培和食用面积最大的蔬菜［1］，其遗传学和分子生物学研究一直受到高度重视［2］。对于白菜的分类有表型形态的分类，也有从细胞学水平分类［3］，随着生物技术的发展，采用分子生物学方法研究大白菜起源演化和分类［4－6］较多。研究大白菜遗传多样性可以克服杂交组合组配的盲目性和提高育种效率［7］。白菜具有自交不亲和的特性，属于天然异花授粉植物，在自然环境条件下很容易“串粉”［8］。因此，白菜亲缘关系复杂，分类多样化。但通过小孢子培养的大白菜可以获得单倍体植株［9］，然后通过自然加倍或人工加倍得到DH(双单倍体)系，不仅不受环境条件的影响，而且可以进行重复试验不断固定遗传信息，有利于拓宽种质资源，克服杂交组合组配的盲目性和提高育种效率。笔者主要利用SSR分子标记的方法，对大白菜的2个DH系群体内遗传多样性进行标记，从分子水平上分析DH系群体内的遗传关系，为大白菜育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料为大白菜的2个品种经小孢子培养获得的2个DH系群体，分别是Y360(60份材料)、YF05(44份材料)，均为河南省农业科学院园艺研究所提供，所有试验均在河南省农科院园艺所分子生物学实验室和蔬菜试验田进行。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。采用CTAB法提取各株系幼嫩叶片DNA。

1.2.2 SSR反应体系及扩增程序。PCR反应总体积为20 μl，其中 dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1U，Mg2+2.5 mmol/L，10 × PCR Buffer 2 μl，上下游引物为0.25 μmol/L，模板 DNA 5 μl(10 ng/μl)，ddH2O 补足至 20 μl。PCR 扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环;最后72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 扩增产物的检测及数据处理。扩增产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，AgNO3染色。数据采用人工计带法，为减小误差，记录清晰可辨的条带，任一位点若有一个或一个以上个体不同于其他个体的位点记为一个多态性位点。对于同一引物的扩增产物，按扩增条带的有无计算，同一位置上迁移率相同清晰的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”。建立0/1距阵。

1.2.4 亲缘关系分析。据“1.2.3”建立的0/1矩阵，利用DPS 7.05版软件，形成下三角，构建聚类图谱。

2 结果与分析

2.1 引物的筛选 通过田间观察，从大白菜DH系材料中选择表型性状差异较大的4份材料，对122对SSR引物进行扩增筛选，从筛选的SSR引物中挑选扩增效果好、多态性好和充分覆盖全基因组的引物12对(表1)。

2.2 SSR的扩增效果 Y360(60份)总共扩增出37条带，29条多态带，多态性比率为78.0%;YF05(44份)总共扩增出41条带，36条多态带，多态性比率为87.8%。总体而言，2个DH系群体材料的多态性较好(图1)，遗传多样性较丰富。

表1 引物信息

2.3 大白菜DH群体遗传多样性分析 从图2可以看出，大白菜DH系Y360群体在遗传距离0.43处分为9个类群，遗传距离在0～0.71，平均相异系数为0.553 2。大白菜DH系YF05聚类图(图3)在遗传距离为0.70处分为2个类群，遗传距离在0.08～ 0.77，平均相异系数为0.6313。第一类群材料数量占整个YF05群体的93%，此类群的材料叶面都有茸毛，第二类群材料叶面都无茸毛。

3 讨论

该研究的DH系群体内有不同程度的变异，这与王涛涛等［10］研究的2个大白菜DH系群体内遗传多样性分析结论相一致。在该试验中YF05、Y360的多态性比率分别是87.8%，78.0%，表明遗传变异程度YF05大于Y360。YF05 DH系群体遗传变异的可能原因有2个:第一，YF05的双亲性状是两个极端，如一个双亲的种子颜色是黑色，另一个是黄色;一个叶表没毛，一个有毛;花色一个是黄色，另一个是白色;抱球类型一个是合抱，另一个是叠抱;一个耐抽薹，另一个易抽薹。第二，2个亲本的来源分别是日本和中国。另DH系Y360群体内部有遗传距离为0的情况(如360-1与Y360-122，Y360-25与Y360-72)。就该试验而言，遗传距离为0并不能说明它们之间遗传背景完全相同，可以认为试验中所用引物标记的相同位点较多。所用标记引物不能区分此类材料，也可能是所用引物标记的数量性状位点较近导致遗传距离较小等原因。对不同作物的遗传多样性研究中，遗传距离为0的情况也存在很多，如在高粱等作物中存在遗传距离为0 的情况［11］。

图1 SSR引物KBRH043E对YF05 DH群体的扩增电泳图谱

图2 Y360 DH系群体聚类图

图3 YF05 DH系群体聚类图

［1］张晓芬，王晓武，娄平，等.利用大白菜DH系群体建立ALFP遗传连锁图谱［J］.园艺学报，2005，32(3):443 －448.

［2］原玉香，张晓伟，孙日飞，等.大白菜遗传图谱的构建及与染色体关联分析［J］.华北农学报，2010，25(3):80 －86.

［3］曹家树，曹寿椿.中国白菜各类群的分支分析和演化关系研究［J］.园艺学报，1997，24(1):35 －42.

［4］孙德岭，赵前程，宋文芹，等.白菜类蔬菜亲缘关系的AFLP分析［J］.园艺学报，2001，28(4):331 －335.

［5］何余堂，陈宝元，傅廷栋，等.白菜型油菜在中国的起源与进化［J］.遗传学报，2003，30(11):1003 －1012.

［6］郭晶心，周乃元，马荣才，等.白菜类蔬菜遗传多样性的AFLP分子标记研究［J］.农业生物技术学报，2002，10(2):138 －143.

［7］刘晓明.利用AFLP、SRAP标记分析不结球白菜遗传多样性［D］.上海:上海交通大学，2008.

［8］刘栓桃，赵智中，何启伟，等.大白菜生物技术研究进展［J］.植物学通报，2004，21(6):709 －718.

［9］黄宝勇，曲士松，孙晋斌，等.大白菜地方种质遗传关系的RAPD分析［J］.西南农业学报，2003，16(2):22 －25.

［10］王涛涛，李汉霞，张俊红，等.两个大白菜DH系群体内遗传多样性分析［M］//中国园艺.学会十字花科蔬菜分会.中国十字花科蔬菜研究进展.北京:中国农业科技出版社，2008.

［11］余传涨，翟国伟，邹桂花，等.41个高粱品种遗传多样性的SSR标记检测［J］.江苏农业学报，2012，26(2):248 －253.