一种快速提取丝核菌(Rhizoctonia spp.)DNA的方法

张正禹，包文静，岳蕊，杨根华(云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明650201)

丝核菌(Rhizoctonia spp.)常以菌丝或菌核的形态习居于土壤中，不产生任何无性孢子，在自然界中广泛存在于土壤及各种不同类型的寄主植物上，许多类群属于植物病原真菌，能侵染多种植物如水稻、玉米、大麦、小麦、大豆等引起严重的病害［1］。该类真菌种类繁多，根据营养菌丝隔膜的结构，丝核菌可分成两类:子囊丝核菌和担子丝核菌(Ceratobasidium spp.);根据细胞核数量多少，担子丝核菌又分为双核和多核丝核菌;在担子丝核菌中最有用的分类依据是菌丝融合群和 5.8S rDNA-ITS 序列［2－4］。

有关丝核菌DNA的提取，国内外普遍采用CTAB提取法［5］和基因组 DNA 提取试剂盒法［6－8］，这几种方法共同缺点是需要大量菌体，操作步骤麻烦，需要耗费大量的时间，效率较低，且在DNA提取过程中需要加入酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂，这些有机溶剂大部分为有毒试剂，对实验人员健康有害，也会污染周边环境，同时提取试剂或试剂盒的价格昂贵，也增加了DNA提取成本。因此，探索一种快捷、安全、有效的DNA提取方法，用于丝核菌菌株大规模的分类鉴定及分子检测显得非常必要。

为建立一套快捷、安全、有效的丝核菌菌株DNA提取方法。笔者采用Chelex-100法提取丝核菌菌株DNA扩增5.8S rDNA-ITS序列，以期得到整齐、明亮、清晰和专一性强、产量高的PCR条带，为快捷、有效地对丝核菌菌株的大规模分类鉴定和分子检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 菌株:云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室保存丝核菌菌株12株。双核丝核菌菌株:J-4，X-4-3-1，J-25，X-4-6-1，BN-J-1，BN-J-2，BN-J-4，BNJ-5，BN-J-7，BN-J-8，BN-J-9;多核丝核菌菌株:BN-J-3。

试剂与仪器:Chelex-100、2 ×Power Taq PCR Master Mix，昆明硕阳生物科技有限公司。引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4(5'-TCCTCGCTTATTGATATGC-3')［9］，由上海生工生物工程有限公司合成。EDC-810型PCR仪，东胜创新生物科技有限公司。

马铃薯琼脂(PDA)培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，补充蒸馏水至1 000 ml，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌30 min。

5%(W/V)Chelex-100 溶液:Chelex-100 5 g，ddH2O 100 ml，pH 7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，4 ℃保存。

1.2 方法 基因组DNA的提取采用Chelex-100法:用无菌竹签从PDA培养基上挑取少量菌丝放入装有50 μl 5%(W/V)菌Chelex-100溶液(pH 7.0)的PCR管中，在旋涡混合器上振荡5 s，EDC-810型PCR仪中94℃加热10 min，自然条件下冷却至室温后，12 000 r/min离心1 min。上清即为PCR模板，－20℃保存备用。

5.8 S rDNA-ITS片段扩增:将Chelex-100法提取的基因组DNA作为PCR扩增模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体系 25 μl包括:1 μl DNA 模板，12.5 μl 2 × Power Taq PCR Master Mix 溶液，正、反向引物各 1 μl(10 μmol/L)，ddH2O 9.5 μl。反应在EDC-810型PCR仪上进行，扩增程序:94℃预变性3 min;94℃变性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，35次循环;最后72℃延伸10 min。取5 μl PCR产物在1%的琼脂糖凝胶120 V电泳40 min，于凝胶成像系统下观察PCR条带质量并拍照。

2 结果与分析

结果表明，所有双核、多核丝核菌菌株采用Chelex-100法提取的基因组DNA，以其作为PCR扩增模板，都能够有效地扩增出5.8S rDNA-ITS序列，PCR产物经过电泳检测，条带整齐、清晰、明亮，专一性强，产量大，无杂带，目的片段大小约700 bp(图1)，可以直接用于测序分析，符合预期试验结果。PCR产物直接进行测序，结果表明，PCR产物均能满足测序要求，且无杂合或者高级结构，都能够得到正确的序列，测序结果较为理想。

图1 供试菌株5.8S rDNA-ITS区段PCR扩增结果

3 结论与讨论

Chelex-100是一种化学螯合树脂，能够螯合多价离子，特别是对高价的金属离子具有很高的亲和力和螯合作用;在低离子强度、碱性以及煮沸的条件下，能够使细胞膜破裂，蛋白质变性，有效地除去非核酸类有机物，通过离心去除Chelex-100颗粒，使DNA与其结合的物质分离。Chelex-100法广泛应用于细菌DNA提取［10］，放线菌DNA 提取［11］，血痕或全血DNA 提取［12－13］，动物源饲料 DNA 提取［14］，植物转基因检测模板DNA的制备［15］以及薯蓣植物炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)和枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的DNA提取［16］等领域。关于Chelex-100法提取丝核菌菌株的DNA尚未见报道。

该研究采用Chelex-100法提取的丝核菌DNA能够直接用于5.8S rDNA-ITS序列PCR扩增模板，电泳条带整齐、明亮、清晰，无杂带，产量大，符合测序要求，测序结果准确;具有快速简便、省时省力和经济高效的特点，在丝核菌的快速分类鉴定和分子检测方面具有重要意义。

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