一株腐败希瓦氏菌的筛选鉴定及其染料脱色研究

江莹，桂震，齐杭杭，罗安杰，刘柳，叶铧骏，蔡亚君(武汉纺织大学环境工程学院，湖北武汉430073)

纺织印染废水有机污染物含量高、色度深、碱性大、水质变化大，一直是难处理的工业废水之一［1］，对其处理通常是将物理法、化学法和生物法串联在一起进行，首先通过物理、化学方法将大部分的有机污染物和色度去除，再采用生物方法将剩余的污染物和色度处理到可以达标排放的水平。因为生物处理方法成本低而且无二次污染，所以在其中起主导作用。但传统的建立在细菌系统上的生物处理技术对非偶氮染料基本没有脱色效果，偶氮染料可以在厌氧条件下脱色，但是几乎不能在好氧条件下脱色。笔者从印染废水中筛选到一株既可在厌氧条件下、也可在好氧条件下对偶氮染料脱色，同时也能在缺氧条件下对蒽醌染料脱色的细菌菌株，对其进行了菌种鉴定，并对其对偶氮和蒽醌染料的脱色条件进行了初步研究。

1 材料与方法

1．1 菌株来源 菌株筛选自某印染厂废水处理厂二沉池活性污泥。

1．2 主要试剂和仪器 用于总基因组提取、PCR产物回收和pMD 18-T载体连接的试剂盒及大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞均购自Takara公司。主要仪器有紫外分光光度计、美国ABI 9800 PCR仪、美国BioRad DNA电泳系统、美国VITEK32全自动细菌鉴定系统。

1．3 高效降解菌的分离及鉴定 将印染废水1∶100加入50 ml浓度为50 mg/L的活性艳蓝KN-R的LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7．0 ～7．5)中，分别在0、50、100、150、200 r/min 转速下、30 ℃下进行培养，定期观察培养基中菌体量及溶液颜色变化。将上清颜色明显褪去的培养物按1∶100转接到新鲜的50 ml浓度为50 mg/L的活性艳蓝KN-R的LB培养基中，重新培养，如此富集培养3次后，将上清脱色效果最好的培养液离心分离菌体，并用无菌水洗涤3次，后悬浮于无菌水中，采用10倍系列梯度等比稀释法将其涂布于50 mg/L活性艳蓝KN-R的LB固体培养基上，30℃下培养，将分离得到的单菌落分别挑至5 ml 50 mg/L活性艳蓝KN-R的LB培养基中培养，观察各自脱色情况，选取效果最好的菌进行平板划线分离纯化。将分离纯化得到的菌株通过美国VITEK32全自动细菌鉴定系统进行生理生化特性鉴定，并提取其总基因组，通过PCR扩增其16S rDNA，扩增得到的PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体并转化进大肠杆菌DH5α菌株中，在含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上挑取克隆子酶切验证后送样测序，测得的序列通过Blast获得其种属信息。

1．4 高效降解菌对染料的脱色研究 将单菌落转接到LB培养基，30℃、150 r/min培养过夜后转接到分别含50 mg/L活性艳红X-3B和50 mg/L活性艳蓝KN-R的LB培养基中，研究在不同温度、pH、通气量条件下培养时该菌对两种染料的脱色效果。

2 结果与分析

2．1 高效染料降解菌株的分离与鉴定

2．1．1 分离。经过筛选，得到一株对活性艳蓝KN-R染料具有很好脱色作用的细菌，该菌在初始接种菌体量107～108CFU/ml、30℃左右静止培养时，在48 h内使50 mg/L以下浓度活性艳蓝KN-R脱色70%左右;而在6 h内即可使50 mg/L以下浓度活性艳红X-3B及多种偶氮染料完全脱色。但对活性艳蓝进行处理时，以染料作为唯一碳源和能源时不能脱色，必须添加其他碳源才能具有脱色效果，且培养液颜色褪去时发现菌体颜色先变蓝后恢复原色;而对活性艳红等偶氮染料进行处理时，以染料作为唯一碳源和能源时可将染料脱色，且在平板上培养时可观察到水解圈现象，因此推测该菌可分泌胞外酶降解偶氮染料，而对活性艳蓝则是一种先吸附、后共代谢的脱色机制。

2．1．2 鉴定。

2．1．2．1 形态学结果。该菌在LB平板上培养时，菌落表面湿润、光滑，浅黄色，不透明，边缘整齐，呈凝滴状(图1a)，菌体呈短杆状(图1b)。

2．1．2．2 生理生化鉴定结果。依据VITEK细菌鉴定系统的预处理要求，将4H菌进行革兰氏染色，发现为阴性;紧接着将菌落做了氧化酶试验，结果呈阳性，属于非发酵菌。将纯种菌50℃下培养6 h，选择非发酵菌的BAC药敏卡，进行全自动鉴定，鉴定结果见表1，最终鉴定结果显示该菌为希瓦氏菌(Shewanella sp．)。

表1 菌株4H生理生化鉴定结果

2．1．2．3 16S rDNA序列鉴定结果。将该菌的16S rDNA序列提交NCBI数据库，进行BLAST对比发现，该菌与所有希瓦氏菌属(Shewanella)菌株16S rDNA序列相似性均达90%以上，与腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)多个菌株的16S rDNA序列相似性均达97%(图2)，与其他希瓦氏菌的相似性也均达90%以上。因此，该菌初步可确定为S．putrefaciens，命名为 S．putrefaciens 4H。

2．2 Shewanella sp．4H对染料的脱色研究 以50 mg/L活性艳红X-3B和活性艳蓝KN-R为目标，将Shewanella sp．4H菌株单菌落转接至LB液体培养基，30℃、150 r/min过夜活化培养后按1∶100分别转接至装有50 ml 50 mg/L活性艳红X-3B和活性艳蓝KN-R LB培养基(pH=7．0)的250 ml三角瓶中，30℃下静置培养，定时取样检测菌体生长量(OD600)和染料脱色效果。由图3a可知，该菌在含50 mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中静置培养6 h左右即可将染料完全脱色(肉眼观察)，此时仍处于菌株的对数生长期;而在50 mg/L活性艳蓝KN-R的LB培养基中培养24 h后进入稳定生长期，48 h后脱色率可达最大值(70%左右)(图3b)。

2．2．1 温度对Shewanella sp．4H菌株染料脱色效果的影响。将Shewanella sp．4H菌株在 LB液体培养基中30℃、150 r/min过夜活化培养的培养物按1∶100分别转接至装有50 ml含50 mg/L活性艳红X-3B和活性艳蓝KN-R LB培养基(pH=7．0)的250 ml三角瓶中，不同温度下静置培养，定时取样检测菌体生长量(OD600)和染料脱色效果。由图4可知，该菌在37℃时菌体生长量及染料脱色率均最高，其次为40℃;在50 mg/L活性艳红X-3B的培养基中，温度低于30℃时菌株生长量明显减少，但最终仍能将染料脱色完全，而高于42℃则菌体几乎不生长，也不表现脱色作用;在50 mg/L活性艳红X-3B的培养基中，温度越低，菌体生长量及染料脱色率均越低，而在45℃时菌体少量生长，具有一定的脱色作用(最高脱色率27．19%)，50℃以上菌体不生长，也不表现脱色作用。

2．2．2 pH对Shewanella sp．4H菌株染料脱色效果的影响。将Shewanella sp．4H菌株在 LB液体培养基中30℃、150 r/min过夜活化培养的培养物按1∶100分别转接至装有50 ml 50 mg/L活性艳红X-3B和活性艳蓝KN-R LB培养基(pH不同)的250 ml三角瓶中，37℃下静置培养，定时取样检测菌体生长量(OD600)和染料脱色效果。由图5可知，在pH为6～8时，该菌在两种染料培养基中均能生长良好;在pH=7和pH=8时生长最好，且染料脱色率最高，pH=8时最优(脱色率分别为90．42%和81．84%)。

2．2．3 通气量对Shewanella sp．4H菌株染料脱色效果的影响。将Shewanella sp．4H菌株在LB液体培养基中30℃、150 r/min过夜活化培养的培养物按1∶100分别转接至装有50 ml 50 mg/L活性艳红X-3B和活性艳蓝KN-R LB培养基(pH=8．0)的 250 ml三角瓶中，37 ℃下分别在转速 0、50、150 r/min下培养，定时取样检测菌体生长量(OD600)和染料脱色效果。由图6可知，该菌在培养时摇床转速越高，菌体生长越快，但脱色效果越差，静置培养时对两种染料的脱色效果均最好(脱色率分别为99．12%和77．18%)。鉴于此，又进一步比较了在相同规格的三角瓶(250 ml)中装样量分别为50、100、150 ml时该菌的生长情况及对染料的脱色情况。结果显示(图7)，装样量越少，菌体生长越好，但对染料最终的脱色效果影响不大，推测已有菌体已足够将含有的染料全部脱色。

3 结论与讨论

筛选到的4H菌株对50 mg/L偶氮染料活性艳红X-3B及蒽醌染料活性艳蓝KN-R均具有很好的脱色能力，尤其对活性艳红X-3B处理6 h后即能完全脱色。研究结果显示，在pH=8、37℃下静置培养时脱色效果最好。该菌株在活性艳红X-3B的平板上培养时可产生水解圈，推断该菌株能分泌降解活性艳红X-3B的胞外酶;该菌株在对50 mg/L活性艳蓝KN-R处理48 h时达到最大脱色率，虽然仅为81．84%，但肉眼观察已经脱色完全，推测通过分光光度法检测该染料浓度时受培养基及菌体代谢物的影响较大;而且该菌必须在培养过程中首先将活性艳蓝KN-R吸入菌体后再逐步将染料降解，推测该菌株降解活性艳蓝KN-R的方式是先吸附、后共代谢方式。后续将对该菌株对活性艳红X-3B类偶氮染料和活性艳蓝KN-R类蒽醌染料的脱色机理进行具体研究。

筛选到的4H菌株经鉴定属于希瓦氏菌属腐败希瓦氏菌种，目前希瓦氏菌属已发现了超过40个种的菌株。希瓦氏菌能利用有机物产生能量，且呼吸类型多样，其应用范围涵盖了医学、环境科学、电化学、海洋生物学等多个领域。其中，4H菌株所属的腐败希瓦氏菌(S．putrefaciens)在各种环境中广泛分布，常见于富含有机质的沉积物和地下厌氧环境中，在厌氧环境中，腐败希瓦氏菌能将腐殖质作为电子穿梭物质还原 Fe(III)［2－5］、Mn(IV)［5］、Cr(VI)［6］、U(VI)［6－8］等金属盐和硝酸盐［9］以及有机污染物［9-12］等。近些年来，还发现某些腐败希瓦氏菌株能产电［13］，而腐败希瓦氏菌对染料降解方面的研究则主要集中于对偶氮染料的降解［14-15］，对蒽醌染料降解方面研究较少。因此，该研究筛选到的S．putrefaciens 4H菌株虽然对染料的脱色作用不如脱色希瓦氏菌［16］，但其在环境污染治理方面的潜力巨大，具有很高的研究价值。

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