不同促透剂对姜黄素凝胶体外透皮作用的影响

·论著·

不同促透剂对姜黄素凝胶体外透皮作用的影响

田芳，胡晋红*(第二军医大学长海医院药学部，上海 200433)

[摘要]目的：制备姜黄素凝胶的外用制剂，考察不同促透剂对姜黄素凝胶的促透作用。方法：建立一种快速、灵敏的液质联用定量分析方法，以裸小鼠离体皮肤为渗透屏障，姜黄素为模型药物，Franz立式扩散法考察各处方姜黄素的体外透皮特性，计算各凝胶处方的累积渗透参数。结果：姜黄素分析方法的线性范围为10～800 ng/ml，定量下限为10 ng/ml；日内、日间精密度良好，RSD均<15%；准确度符合要求。在1%的促透浓度下，6种促透剂对姜黄素的促透作用由强至弱依次为月桂氮酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、油酸、丙二醇、薄荷脑、卵磷脂。结论：姜黄素的HPLC-MS/MS分析方法符合要求，月桂氮酮对姜黄素具有显著的促透作用。

[关键词]姜黄素；促透剂；经皮渗透；色谱法，高效液相；质谱

[中图分类号]R943[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150511

作者简介田芳(男)，硕士.

[收稿日期]2015-09-01

Influence of different penetration ehhancer oninvitrotransdermal effect of curcumin gel

TIAN Fang, HU JinHong*(Department of Pharmacy, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China)

ABSTRACT[]Objective: To prepare curcumin gel with different penetration enhancer and study their skin permeation in vitro. Method: A rapid and sensitive HPLC-MS/MS quantitative method was established. Nude mouse skin was used as permeation barrier and curcumin was selected as a model drug. Franz diffusion method was adopted to investigate the in vitro transdermal characteristics and the cumulative penetration parameters of each curcumin gel were calculated. Results: The calibration curve of curcumin had satisfactory linearity within the range of 10-800 ng/ml and the lower limit of quantitation was 10 ng/ml. The intra-day and inter-day RSD were <15%, and accuracy met the specified requirements. Under 1% penetration enhancing concentration,the penetration enhancing effects of 6 enhancers on curcumin were in sequence: azone, N-methyl-2-pyrrolidone,oleic acid, propylene glycol, menthol and lecithin. Conclusion: The HPLC-MS/MS method of curcumin met the requirements,azone had outstanding transdermal effect on curcumin gel.

[KEY WORDS]curcumin；penetration enhancer；skin permeation；chromatography,high performance liquid;mass spectrometry

[Pharm Care Res，2015，15(5): 357-360]

E-mail: tfang2013@126.com

*通信作者(Corresponding author)：胡晋红，E-mail: hjhong2016@126.com

姜黄素是从郁金、姜黄、莪术等姜科植物中提取的一种酚类化合物[1,2]，具有广泛的药理作用和生物学活性。但鉴于其自身的理化性质，姜黄素口服后不易吸收，体内代谢迅速，生物利用度低等因素[3,4]，尚未作为一种治疗药物在临床使用。与口服给药相比，经皮给药具有避免肝首关效应及胃肠灭活、维持恒定的血药浓度、延长药物作用时间等优点。

本研究选用凝胶作为外用给药剂型，在已有报道的基础上选用月桂氮酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、油酸、丙二醇、薄荷脑、卵磷脂作为凝胶促透剂，采用1%(m/m)的浓度作为促透剂浓度，以不加促透剂的凝胶作为对照，制备出7种不同的姜黄素凝胶。此外，建立姜黄素定量分析的HPLC-MS/MS测定方法，通过该方法测定7种凝胶透皮后接收液的浓度，并以7种凝胶的12 h累计渗透量和渗透速率为考察指标，优化出具有最佳促透作用的姜黄素凝胶，为姜黄素凝胶的经皮给药提供理论依据和实验基础。

1材料和方法

1.1试药和仪器姜黄素原料药由Sigma 公司提供；姜黄素对照品(规格20 mg，纯度≥98.8%)、内标和厚朴酚对照品(规格20 mg，纯度≥98.8%)由中国食品药品检定研究院提供；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；冰乙酸(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；月桂氮酮(分析纯)、薄荷脑(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；羟丙基纤维素、N-甲基-2-吡咯烷酮(分析纯)、油酸(分析纯)、丙二醇(分析纯)和卵磷脂(分析纯)购自上海源源化学试剂有限公司；乙醇(分析纯，常熟市鸿盛精细化工有限公司)；氯化钠(上海凌风化学试剂有限公司)；蒸馏水(屈臣氏集团)。

Aglient Extend C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)，Agilent Extend C18保护柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，三重四级杆液质联用系统(美国Aglient公司)；JA51001 电子天平(上海精天电子仪器有限公司)； XW-80A涡旋混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；Franz扩散池、透皮扩散仪(第二军医大学长海医院药学部)。

1.2实验动物BALB/c裸小鼠，雄性，6～8周龄，体重(21.7±1.4) g, 购自第二军医大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(沪)2012-0016。

1.3实验方法

这天晚上，阿东一直坐在床边，看着阿里睡着。他心里很难过，不知道怎样才能安慰阿里，也不知道怎样才能帮到阿里。

1.3.1HPLC-MS/MS分析方法流动相为乙腈∶0.05%冰醋酸水溶液(55∶54，V/V)，流速0.3 ml/min，色谱柱温度30 ℃，进样量5 μl，样品运行时间4.5 min。离子源为电喷雾离子源(ESI源)，负离子方式检测，毛细管电压4 kV，源温度100 ℃，去溶剂化温度350 ℃，去溶剂化气体流速(N2) 6 L/min，辅助雾化气(N2)压力172.4 kPa (25 psi，1 psi=6.985 kPa)，分析中采用多离子反应监测(multiple reaction monitor,MRM)定量，优化后姜黄素和内标(和厚朴酚)的MRM见表1。

表1　姜黄素与和厚朴酚多离子反应监测参数

1.3.2Franz扩散池接收液的配制精密称取氯化钠0.9 g，溶解并稀释至100 ml，制得浓度为0.9%的氯化钠溶液(生理盐水)。分别取乙醇和生理盐水适量，按30∶70(V∶V)的比例制备浓度为30%的乙醇生理盐水溶液。该溶液超声脱气30 min后作为空白接收液。

1.3.3对照品溶液的配制精密称量姜黄素对照品0.01 g，用甲醇溶解并稀释制得储备液Ⅰ(100 μg/ml)和储备液Ⅱ(10 μg/ml)。同法配制浓度为300 ng/ml的内标和厚朴酚工作液。以姜黄素储备液Ⅱ为母液，用空白接收液逐级稀释，制得浓度为10、20、50、100、200、500、800 ng/ml的姜黄素系列标准溶液。取各浓度标准液30 μl加入5 μl和厚朴酚工作液，涡旋混匀后，进样5 μl，用HPLC-MS/MS法测定。

1.3.4姜黄素凝胶的制备精密称量羟丙基纤维素3 g，均匀撒于72 g蒸馏水中，溶胀过夜，制得姜黄素凝胶基质。称取姜黄素1 g，并用10 g无水乙醇超声溶解，溶解后按表2项下的处方配比(即处方1至处方7)，分别加入各自处方剂量的促透剂(对照中加入等量的蒸馏水)，溶解并混匀，制得姜黄素溶液。将该溶液倒入姜黄素凝胶基质，同时用总计7 g的无水乙醇润洗制备姜黄素溶液所需器皿，润洗后一并倒入姜黄素凝胶基质，持续搅拌30 min后，加蒸馏水调整各处方至100 g，继续搅拌30 min，直至姜黄素凝胶形成。

表2　姜黄素凝胶的组成

1.3.5离体皮肤的制备将裸小鼠颈椎脱臼处死，剪取背部皮肤，剥离皮下脂肪组织及筋膜，用等渗生理盐水清洗皮肤至澄清，用铝箔纸包裹后存放于-20 ℃冷冻保存，一周内使用。

1.3.6姜黄素凝胶的体外透皮实验将空白接收液超声脱气后转移至Franz垂直扩散池的接收池中。取离体裸小鼠皮肤至生理盐水中冲洗并解冻，裁剪成适当大小，固定于Franz垂直扩散池的扩散界面，角质层面向供给池，真皮层面向接收池，分别将0.5 g的各处方姜黄素凝胶(表2)涂布于离体裸鼠皮肤的角质层，水浴温度调至32 ℃，200 r/min条件下持续搅拌，分别于给药后的2、4、6、8、10、12 h从接收池中移取0.1 ml，并补充等温、等体积的空白接收液于接收池中。取各时间点待测接收液10 μl，加入90 μl空白接收液，将混合后的接收液涡旋混匀1 min，取30 μl该混合液加入5 μl和厚朴酚工作液(300 ng/ml)，涡旋1 min后，移取5 μl进样HPLC-MS/MS定量分析。按公式Qn=(Cn×Vp+Cn-1×Vq+……+C1×Vq)/A，计算各取样时间点的累计渗透量，其中Cn表示第n个取样点接收液浓度，Vp表示接收池体积(4.2 ml)，Vq表示每次从接收池中取样体积(0.1 ml)，A表示有效透析面积(0.85 cm2)，Qn表示第n个取样点单位面积下的累计渗透量。

2结果

2.1姜黄素的分析结果姜黄素的色谱保留时间为2.08 min，和厚朴酚的色谱保留时间为3.51 min，两者分离良好，无相互干扰，皮肤内源性物质及接收液中外源性物质不干扰姜黄素及和厚朴酚的测定，接收液样品中成分即为待测物姜黄素(见图1)。对姜黄素和内标和厚朴酚进行质谱分析，可得两者的母离子和碎片离子的质谱图，结果见图2。姜黄素母离子的分子离子峰为367.1，碎片离子的分子离子峰为149.0，内标和厚朴酚母离子的分子离子峰为265.1，碎片离子的分子离子峰为224.1。

图1　姜黄素及和厚朴酚的HPLC谱图 Figure 1　HPLC photograms of curcumin and honokiol A：50 ng/ml的姜黄素标准液；B：300 ng/ml的和厚朴酚 工作液；C：姜黄素凝胶体外透皮实验中接收液样品； 1：姜黄素；2：和厚朴酚

表3　姜黄素质控样品的日内、日间精密度和准确度

2.3不同促透剂对姜黄素的促透作用用Graphpad Prism 6 软件处理不同取样时间点下单位面积的累计渗透量，计算各处方的体外渗透参数，结果见表4。表4中，与对照组(处方7)相比，6种促透剂均显示出对姜黄素的促透作用，其中月桂氮酮对姜黄素具有明显的促透作用，其单位面积下12 h累计渗透量为(36.32±1.20) μg/cm2，渗透速率为(3.78±2.04) μg·cm-2·h-1。6种促透剂对姜黄素的促透作用依次为月桂氮酮>N-甲基-2-吡咯烷酮>油酸>丙二醇>薄荷脑>卵磷脂。

表4　不同处方姜黄素凝胶的体外渗透参数

3讨论

通常体外透皮实验的定量分析采用HPLC仪或紫外分光光度计，本研究结合已有文献报道[5,6]和研究条件建立了姜黄素的HPLC-MS/MS分析方法。该方法在文献报道的基础上，将色谱的梯度洗脱优化为等度洗脱，缩短了单个样品的分析时间，另一方面在保证色谱柱的柱压不超过最大压力的同时缩短样品的分析时间，将流动相的流速优化为0.3 ml/min。在质谱方面，本研究在确定姜黄素母离子和碎片离子的m/z后，分别对碰撞能量和裂解能量进行优化，以获得最佳的MRM参数。和已有方法相比，该分析方法灵敏度高、特异性好、色谱基线平稳，姜黄素和内标出峰良好，响应值高，样品的分析时间短。

图2　姜黄素及和厚朴酚的质谱图 Figure 2　Mass spectra photograms of curcumin and honokiol A：姜黄素的一级质谱图；B：姜黄素的二级质谱图；C：和厚朴酚的一级质谱图；D：和厚朴酚的二级质谱图

在体外经皮渗透的研究中，6种促透剂对姜黄素分别具有不同的促透效果，促透剂的促透效果与其作用机制密切相关。月桂氮酮和N-甲基-2-吡咯烷酮同属于氮酮类化合物，该类化合物可使细胞间脂质排列有序性下降，扩大角质层中的细胞间空隙，提高细胞间隙药物的通过量。油酸对药物的增溶作用是其主要的促透机制。丙二醇作为醇类化合物能溶胀和提取角质层中的类脂，增加药物的溶解度，从而提高极性和非极性药物的经皮吸收。薄荷脑的主要成分是一些萜烯类化合物，这些物质可以通过刺激皮下毛细血管的血液循环提高药物的经皮吸收。卵磷脂作为表面活性剂自身可以渗入皮肤，并与皮肤成分相互作用，改变其渗透性质。

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[修回日期]2015-09-14

[本文编辑]吴铭权