葡萄糖调节蛋白78在小鼠胰腺癌发生演进过程中的表达变化

牛哲禹，刘乔飞，王梦一，周 立，姚鲁田，廖 泉，赵玉沛

中国医学科学院 北京协和医院 北京协和医院基本外科，北京100730

葡萄糖调节蛋白78在小鼠胰腺癌发生演进过程中的表达变化

牛哲禹，刘乔飞，王梦一，周 立，姚鲁田，廖 泉，赵玉沛

中国医学科学院 北京协和医院 北京协和医院基本外科，北京100730

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在胰腺癌发生演进过程中的表达及意义。方法 通过二甲基苯并蒽(DMBA)胰腺原位包埋建立免疫健全C57BL/6J小鼠慢性胰腺炎、胰腺导管上皮内瘤变(PanIN)及胰腺癌发生演进模型，采用免疫组织化学技术检测GRP78在胰腺癌发生演进各阶段的表达变化。结果 建立60例DMBA包埋模型，其中18例(30%)于观察期间死亡，共获得慢性胰腺炎9例(15%);PanIN 18例(30%)，包括PanINⅠ5例(8．3%)，PanINⅡ9 例(15%)，PanINⅢ4例(6．7%);胰腺癌15例(25%)。免疫组织化学结果显示，胰腺癌组织中GRP78表达显著高于癌旁正常导管细胞(χ2=13．39，P=0．000)，胰腺癌及高级别PanIN中的GRP78表达明显高于低级别PanIN和慢性胰腺炎组织中的表达(χ2=17．84，P=0．000)。结论 GRP78的表达在胰腺癌各阶段差异显著，与胰腺癌的发生及演变相关。

胰腺癌;胰腺上皮内瘤变;葡萄糖调节蛋白78

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):259-263

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，发病隐匿、进展迅速、手术切除率低、放化疗效果不佳，预后极差，总体5年生存率大约为6%，在全球癌症发病率占第13位，死亡率占第7位［1］。胰腺癌的早期预警及发生发展机制一直是国内外研究的热点，慢性胰腺炎和胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)被认为是胰腺导管上皮癌变的早期事件，反映了胰腺癌的发生和渐进演变［2］。

葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)又称免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein，BIP)，为热休克蛋白70家族的一员，位于细胞内质网，是调节内质网应激、启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)的重要分子。GRP78在内质网中可促进蛋白质的正确折叠，维持内质网正常功能，在细胞处于缺氧、低糖等应激状态时，提高细胞的生存能力［3］。近期研究显示，GRP78在胰腺癌中呈高表达，与患者的预后相关，但在胰腺癌发生及演进过程中的动态变化尚不清楚［4］。本研究通过二甲基苯并蔥(dimethylbenzanthracene，DMBA)原位埋入免疫健全C57BL/6J小鼠的胰腺实质建立慢性胰腺炎、PanIN及胰腺癌的发生演进模型，采用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色技术检测了GRP78在正常胰腺导管上皮、PanIN和胰腺癌中的表达变化，探讨了PanIN 和GRP78与胰腺癌发生及演变的关系。

材料和方法

实验动物和材料 4～6周龄雄性C57BL/6J小鼠60只，购于北京维通利华实验动物有限公司，饲养于SPF级环境。GRP78单抗购自英国Abcam公司，二步法染色试剂盒购自丹麦Dako公司，二抗及IHC试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。本研究动物实验均通过中国医学科学院北京协和医院动物伦理委员会审查。

动物模型建立 小鼠术前禁食不禁水4 h，腹腔注射水合氯醛麻醉(10%，30 μl/10 g)，10%硫化钠腹部脱毛后酒精消毒皮肤，取腹部正中切口长约3 cm，暴露胰腺，将远端胰腺及脾脏轻柔拉出腹腔，细线在远端胰腺预缝荷包，将DMBA(Sigma-Aldrich，USA)粉末(1 mg/25 g)植入荷包内，拉紧缝线打结，还纳腹腔，关腹前反复检查，确保无DMBA泄漏入腹腔。所有存活小鼠均在术后2个月处死。

取材及病理学检查 全部小鼠处死后解剖腹腔，观察胰腺大小质地及肿瘤生长状况，肝脏、脾脏、胆管、肠系膜转移情况。剖开胸腔，观察肺脏的转移情况。取出全部胰腺、肝脏、肺脏置于10%福尔马林溶液固定24 h，常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红染色，病理科医师光镜下判断病理学变化，诊断标准及PanIN技术和分级标准根据美国国立癌症研究所于1999年制定的诊断标准［5］进行。

免疫组织化学染色检测GRP78的表达 采用GRP78单抗(ab108613，Abcam，Cambridge，UK)和二步法染色试剂盒(EnVision+kit，Dako，Glostrup，Denmark)进行染色，具体为:石蜡包埋的组织制成4 μm的连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化;PBS冲洗去除内源性过氧化物酶，置于煮沸的pH值6．0的枸橼酸盐缓冲液中高温高压修复抗原;PBS冲洗后，1∶100的一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗后加入辣根酶标记的羊抗兔二抗100 μl，将切片放入恒温箱37℃孵育1 h，PBS冲洗DAB显色;用苏木素将切片染色1 min，用水反复冲洗多次去除背景;分化返蓝，冲洗后脱水、透明、封片，显微镜观察并照相。阴性对照采用免疫前的兔血清。

结果判断标准 光镜下观察，由2个观察者分别进行评分，具体为:(1)根据染色强度将染色分为0～3分，阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性2分，强阳性为为3分;(2)根据视野内阳性细胞比例将染色分为1～4分，＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，75%～100%为4分;(3)将(1)和(2)2项的得分相乘，最终得分取2个观察者平均值，得分≤6分为低表达，＞6分为高表达。

统计学处理 采用SPSS 18．0统计软件包，GRP78表达强度差异采用卡方检验，P＜0．05为差异有统计学定义。

结果

建模情况 60只小鼠中有18只(30%)于观察期间死亡，其中2只体形消瘦，腹部膨隆，剖腹可见大量血性腹水，腹腔内脏器广泛黏连，胰腺部位肿瘤分别为1．3 cm和1．5 cm(长径)，浸润至小肠及腹壁，疑似DMBA泄露至腹腔所致。术后2个月处死所有剩余的42只小鼠，可见其胰腺变硬，肿胀，与周围组织黏连，均伴有不同程度的腹水，未见肉眼可见肝脏及肺转移。

HE染色结果 42只成功建模的小鼠中，慢性胰腺炎9例(15%);PanIN病变18例(30%)，其中，PanINⅠ5例(8．3%)，PanINⅡ9例(15%)，PanIN Ⅲ4例(6．7%);胰腺癌15例(25%)，其中，导管腺癌14例，胰腺纤维肉瘤1例。肝脏及肺脏均未检出转移癌。将PanINⅠ级定义为低级别胰腺上皮内瘤变(L-PanIN)，共5例;Ⅱ级和Ⅲ级定为高级别胰腺上皮内瘤变(H-PanIN)，共13例。

免疫组织化学染色结果 GRP78在癌旁组织、慢性胰腺炎和L-PanIN中主要为低表达，在H-PanIN和胰腺癌中主要为高表达(图1、表1)。胰腺癌发展各阶段的GRP78表达差异有统计学意义(χ2=22．23，P=0．000)，其中，GRP78在胰腺癌中的表达显著高于癌旁组织(χ2=13．39，P=0．000)，在胰腺癌和H-PanIN中的表达显著高于 L-PanIN和慢性胰腺炎(χ2=17．84，P=0．000)。

表1 GRP78在胰腺癌发生演进过程中的表达变化Table 1 Expression of GRP78 during the occurrence andprogression of pancreatic cancer neosplasia

图1 GRP78在小鼠胰腺癌发生及演进各阶段中的表达情况(免疫组织化学染色，×400)Fig 1 Expression of GRP78 in the occurrence and progression of the mouse pancreatic cancer(immunohistochemistry，×400)

讨论

胰腺癌早期缺乏典型症状和有效的筛选指标，发现时往往已处于晚期，失去了手术机会。因此，胰腺癌的发生及演进过程是肿瘤研究的热点，以期能筛选出提供早期预警的临床病理学指标及分子标志物。以往研究表明，慢性胰腺炎和PanIN为胰腺癌癌前病变，是研究胰腺癌发生及演变的重要途径［2］，但临床中慢性胰腺炎及PanIN的标本获取困难，限制了胰腺癌的炎癌转化研究，因此设计胰腺癌及癌前病变的动物模型并利用其开展胰腺癌发生演变的研究具有重要的实际意义。以往研究显示，利用SD大鼠DMBA包埋及Kras突变小鼠建立胰腺癌和PanIN模型耗时较长，花费较大［6-7］。将DMBA溶液注射入C57BL/6J小鼠胰腺远端进行胰腺癌建模的成功率约为30%［8］，但小鼠胰腺体积小、薄，DMBA溶液流动性强，容易从针孔溢入腹腔，定量困难。本研究则采用药物包埋的方法，有效解决了此问题，PanIN和胰腺癌建模总成功率达到55%，模型的稳定性大大增加。

GRP78是UPR最重要的伴侣蛋白，被认为是UPR激活的标记分子。当细胞处于缺氧、钙离子失调、DNA损伤和毒性物质刺激时，内质网中的未折叠蛋白和错误折叠蛋白会发生累积，继而诱发内质网应激并通过UPR进行适应。本研究采用小鼠胰腺癌发生演进模型检测了GRP78在慢性胰腺炎导管上皮细胞、PanIN及胰腺癌中的表达变化，结果显示，随着胰腺癌的发生及演进，GRP78表达具有明显的规律性:在慢性胰腺炎和癌旁组织中大部分胰腺导管上皮细胞中GRP78呈低表达，说明在病变早期，胰腺导管上皮细胞内质网应激初步呈现，细胞代谢异常不明显。随着癌前病变的进展，GRP78的表达显著增高，高表达的比例在H-PanIN和胰腺癌中显著增加，说明随着胰腺病变的发生和进展，病变细胞中的内质网应激相应加重，需要启动UPR进行适应，进而保护细胞。这一发现与食管癌、子宫内膜癌和卵巢癌的相关文献报道类似［9-11］，提示GRP78在多种肿瘤细胞的发生过程中均扮演了重要角色。以往研究也证实，实体肿瘤细胞的快速增殖可导致严重的内质网应激，继而通过GRP78表达启动UPR，阻止细胞凋亡发生，起到保护细胞的作用。此外，恶性肿瘤的生长速度快于血管生成速度，其细胞处于缺血缺氧的状态也会引起内质网应激并诱导GRP78的过表达［12］。GRP78表达可直接反映细胞内质网应激程度，并间接反映肿瘤细胞的生长速度，有望成为协助诊断及预后判断的生物学标志物。在胃癌及肝细胞肝癌中的研究也证实，GRP78高表达与患者不良预后密切相关，肝癌细胞体外实验显示GRP78可通过增加黏着斑激酶的表达增强肿瘤转移能力，敲低GRP78表达可显著降低肿瘤细胞的增殖速度和异体移植瘤的生长［13-14］。

综上，本研究结果显示，GRP78的表达在胰腺癌发生及演变过程具有显著的动态变化过程，其高表达可反映胰腺癌前病变的严重程度及胰腺癌的发生，进一步深入研究GRP78在人胰腺癌发生及演变中的分子作用机制并挖掘其临床应用价值具有重要意义。

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Changes in the Expression of Glucose-regulated Protein 78 in the Occurrence and Progression of Pancreatic Cancer in Mouse Models

NIU Zhe-yu，LIU Qiao-fei，WANG Meng-yi，ZHOU Li，YAO Lu-tian，LIAO Quan，ZHAO Yu-pei

Department of General Surgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Objective To investigate the changes in the expression of glucose-regulated protein 78(GRP78)in the occurrence and progression of pancreatic cancer in mouse models．Methods The mouse models of chronic pancreatitis，pancreatic intraepithelial neoplasia(PanIN)，and pancreatic cancer were successfully established by dimethyl benzene and anthracene(DMBA)embedding in situ．GRP78 expression was detected in various stages by immunohistochemistry．Results Of these 60 mouse models，18 mice(30%)died during the observation period．Two months after the embedding，the survived mice were sacrificed，and HE staining and IHC staining were performed．Among these mice，9(15%)developed chronic pancreatitis;18(30%)had PanIN［PanINⅠ，5(8．3%);PanINⅡ，9(15%);and PanINⅢ，4(6．7%)］;15(25%)developed pancreatic cancer．Immunohistochemistry showed that the expression of GRP78 in pancreatic cancer tissue wassignificantly higher than that in adjacent noncancerous duct cells(χ2=13．39，P=0．000)．Also，GRP78 expression in pancreatic cancer tissue and high grade PanIN was significantly higher than that in low grade PanIN and chronic pancreatitis(χ2=17．84，P=0．000)．Conclusion The expression of GRP78 remarkably differs in different stages of pancreatic cancer and therefore is associated with the occurrence and progression of this disease．

pancreatic cancer;pancreatic intraepithelial neoplasia;glucose-regulated protein 78

LIAO Quan Tel/Fax:010-69156007，E-mail:lqpumc@126．com; ZHAO Yu-peiTel:010-69156007，E-mail:zhao8028@263．net

R735．9

A

1000-503X(2015)03-0259-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．002

2014-12-15)

廖 泉 电话/传真:010-69156007，电子邮件:lqpumc@126．com;赵玉沛 电话:010-69156007，电子邮件:zhao8028@263．net

国家高技术研究发展计划项目(863项目) (2012AA02A212)和国家自然科学基金(81272573)Supported by the National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(2012AA02A212)and the National Natural Sciences Foundation of China(81272573)